实训12 病毒的血凝和血凝抑制试验
一、目的要求
（1）掌握鸡新城疫病毒的红细胞凝集和凝集抑制试验（微量法）的操作方法。
（2）掌握这两个试验的判定方法。
二、仪器及材料
96 孔V 型微量血凝集反应板、微量吸液器、微量振荡器、玻璃注射器、离心管、离心机、灭菌生理盐水、0.5%鸡红细胞悬液、鸡新城疫弱毒疫苗Ⅱ系或Lasota 系、鸡新城疫标准阳性血清和阴性血清、被检血清。
三、方法与步骤
1.试验准备
0.5%红细胞液的制法：由鸡翅静脉或心脏采血，放入灭菌试管内（按每毫升血加入3.8%灭菌枸橼酸钠0.2 mL 做抗凝剂），迅速混匀，将此血液注入离心管中，经3 000 r/min，离心5～10 min，用吸管吸去上清液和红细胞上的白细胞薄膜，将沉淀的红细胞加生理盐水洗涤，如此反复洗涤3 次，将最后一次离心后的红细胞，按0.5%的稀释度加入生理盐水即配成0.5%鸡红细胞生理盐水悬液。
2.病毒的红细胞凝集试验（微量法）
（1）用微量吸液器每孔均滴加生理盐水0.025 mL。
（2）用微量吸液器再吸取0.025 mL 病毒，滴于第1 孔中，用吸液器挤5 次混合后吸至第2 孔，依次倍比稀释到第11 孔，弃去0.025 mL，病毒稀释倍数依次为1∶2～1∶2 048，第12 孔做对照。
（3）以微量吸液器，每孔加0.5%鸡红细胞悬液0.025 mL。
（4）置于振荡器上振荡混匀约1 min，放入37 ℃恒温箱中15～30 min，取出观察结果。
注：++++表示完全凝集；++表示不完全凝集；—表示不凝集。
观察结果：将反应板倾斜成45°，沉于管低的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔低的红细胞铺平孔低，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。
病毒液的HA 效价1∶256，HI 试验时，病毒抗原液0.025 mL 内须含4 个凝集单位，则应将病毒液做成256/4 =64 倍的稀释液。
3.病毒的红细胞凝集抑制试验（HI）
（1）用微量吸液器1～10 孔均滴加生理盐水0.025 mL，第11 孔滴加0.05 mL。
（2）用微量吸液器再吸取0.025 mL 被检血清，滴于第1 孔中，用吸液器挤5 次混合后吸至第2 孔，依次倍比稀释到第10 孔，弃去0.025 mL，被检血清稀释倍数依次为1∶2～1∶1 024。
（3）以微量吸液器，每孔加入含有4 个单位的病毒液0.025 mL 至第10 孔，第11 孔为红细胞对照孔，不加病毒液。
（4）置于振荡器上振荡混匀约1 min，放入37 ℃恒温箱中15～20 min。
（5）以微量吸液器，每孔加0.5%鸡红细胞悬液0.025 mL，放振荡器上振荡1～2 混匀，置15～30 min，判定结果。
（6）每次试验应做抗原对照管。
注：—表示不凝集；++表示不完全凝集；++++表示完全凝集。
四、实验结果
将反应板倾斜成45°，沉于管低的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔低的红细胞铺平孔低，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。
能将4 单位病毒物质凝集红细胞的作用完全抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清的红细胞凝集抑制效价，用被检血清的稀释倍数或以2 位底的对数表示。