实训11 鸡胚接种技术
一、目的要求
（1）掌握病毒的鸡胚培养方法。
（2）掌握病毒的鸡胚接种技术。
二、仪器及材料
消毒设备、注射器、头皮针、滴管、接种环、酒精灯、受精卵、照蛋器、孵化设备、卵盘、卵杯、接种箱、眼科镊子和剪子、毛细吸管、锥子、灭菌平皿、恒温箱、碘酒、70%酒精、镊子、剪刀、封蜡。
三、方法与步骤
1.准备蛋胚
孵育前的鸡卵先用清水以布洗净，再用干布擦干，放入孵卵器内进行孵育（37 ℃，相对湿度是45%～60%），孵育3 日后，鸡卵每日翻动1～2 次。孵至第4 日，用检卵灯观察鸡胚发育情况，未受精卵，只见模糊的卵黄黑影，不见鸡胚的形迹，这种鸡卵应淘汰。活胚可看到清晰的血管和鸡胚的暗影，比较大一些的可以看见胚动，随后每日观察1 次，将胚动呆滞或没有运动的、血管昏暗模糊者，即可能是已死或将死的鸡胚，要随时加以淘汰。生长良好的蛋胚一直孵育到接种前，具体胚龄视所拟培养的病毒种类和接种途径而定。
2.接种
（1）绒毛尿囊膜接种。
①将孵育10～12 天的蛋胚放在检卵灯上，用铅笔勾出气室与胚胎略近气室端的绒毛尿囊膜发育得好的地方。
②用碘酒消毒气室顶端与绒毛尿囊膜记号处，并用磨壳器或齿钻在记号处的卵壳上磨开一个三角形或正方形（每边为5～6 mm）的小窗，不可弄破下面的壳膜。在气室顶端钻一个小孔。
③用小镊子轻轻揭去所开小窗处的卵壳，露出壳下的壳膜，在壳膜上滴1 滴生理盐水，用针尖小心地划破壳膜，但注意切勿伤及紧贴在下面的绒毛尿囊膜，此时生理盐水自破口处流至绒毛尿囊膜，以利两膜分离。
④用针尖刺破气室小孔处的壳膜，再用橡皮乳头吸出气室内的空气，使绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室。
⑤用注射器通过窗口的壳膜窗孔滴0.05～0.1 mL 牛痘病毒液于绒毛尿囊膜上。
⑥在卵壳的窗口周围涂上半凝固的石蜡，做成堤状，立即盖上消毒盖玻片。也可用揭下的卵壳封口，并将卵壳盖上，接缝处涂以石蜡，但石蜡不能过热，以免流入卵内。将鸡卵始终保持人工气室在上方的位置进行37 ℃培养，48～96 h 观察结果。
（2）尿囊腔接种。用孵育10～12 天的蛋胚，因这时尿囊液积存得最多。
①将蛋胚在检卵灯上照视，用铅笔画出气室与胚胎位置，并在绒毛尿囊膜血管较少的地方作记号。
②将蛋胚竖放在蛋座木架上，钝端向上。用碘酒消毒气室蛋壳，并用钢针在记号处钻一小孔。
③用带18 mm 长针头的1 mL 注射器吸取鸡新城疫病毒液，针头刺入孔内，经绒毛尿囊膜入尿囊腔，注入0.1 mL 病毒液。
④用石蜡封孔后于37 ℃孵卵器孵育72 h。
（3）羊膜腔接种。
①将孵育10～11 天的蛋胚照视，画出气室范围，并在胚胎最靠近卵壳的一侧作记号。
②用碘酒消毒气室部位的蛋壳。用齿钻在气室顶端磨一个三角形，每边约1 cm 的裂痕。注意勿划破壳膜。
③用灭菌镊子揭去蛋壳和壳膜，并滴加1 滴灭菌液体石蜡于下层壳膜上，使其透明，以便观察，若将蛋胚放在检卵灯上，则看得更清楚。
④用灭菌尖头镊子，两页并拢，刺穿下层壳膜和绒毛尿囊膜没有血管的地方，并夹住羊膜从刚才穿孔处拉出来。
⑤左手用另一把无齿镊子夹住拉出的羊膜，右手持带有26 号针头的注射器，刺入羊膜腔内，注入鸡新城疫病毒液0.1 mL。针头最好用无斜削尖端的钝头，以免刺伤胚胎。
⑥用绒毛尿囊膜接种法的封闭方法将卵壳的小窗封住，于37 ℃孵卵器内孵育48～72 h，保持蛋胚的钝端朝上。
3.收获
（1）绒毛尿囊膜。
①用碘酒消毒人工气室上的卵壳，去除窗孔上的盖子。
②将灭菌剪子插入窗内，沿人工气室的界限剪去壳膜，露出绒毛尿囊膜，再用灭菌眼科镊子将膜正中夹起，用剪刀沿人工气室边缘将膜剪下，放入加有灭菌生理盐水的培养皿内，观察病灶形状。然后或用于传代，或用50%甘油保存。
（2）尿囊腔接种法收获尿囊液。
①将蛋胚放在冰箱内冷冻半日或一夜，使血管收缩，以便得到无胎血的纯尿囊液。
②用碘酒消毒气室处的卵壳，并用灭菌剪刀除去气室的卵壳。切开壳膜及其下面的绒毛尿囊膜，翻开到卵壳边上。
③将鸡卵倾向一侧，用灭菌吸管吸出尿囊液。一个蛋胚可收获6 mL 左右尿囊液。若操作时损伤了血管，则病毒会吸附在红细胞上，尿囊液成为无用。收获的尿囊液经无菌试验后，可在4 ℃以下的温度中保存。
④观察鸡胚，看有无典型的症状。
（3）羊膜腔接种法收获羊水。
①按收获尿囊液的方法消毒、去壳，翻开壳膜和尿囊膜。
②先吸出尿囊液，再用镊子夹出羊膜，以尖头毛细吸管插入羊膜腔，吸出羊水，放入灭菌试管内，每蛋胚可吸0.5～1.0 mL。经无菌试验后，保存于低温中。
③观察鸡胚的症状。