3.16 单细胞肿瘤检测技术
随着现代医学技术的发展，肿瘤已进入个体化诊疗阶段。传统诊断技术对肿瘤整体进行检测，从而忽略了“细节”，即每个细胞间的差异。单细胞技术是科技发展史上的又一大创举，近些年发展迅速，特别是偶联高通量二代测序技术，可以实现针对肿瘤微环境中的每个细胞多维度深度解析（基因组、转录组或表观遗传及空间分布等），为肿瘤患者带来更为精准的诊断及临床治疗评估等。一个细胞里的DNA或RNA大约在皮克（picogram）级的水平，而单个细胞内的遗传物质量远远达不到现有测序仪检测的最低要求。因此，科学家们发明了单细胞测序技术，该技术是利用PCR等方法对单个细胞中的微量核酸分子进行线性扩增，获得满足测序要求的核酸分子，结合二代测序以及生物信息学等方法最终成功解析单细胞的遗传信息。该项技术的研发，对癌症早期的诊断、追踪以及个体化治疗具有重要意义（图3.30）。
图3.30 单细胞测序技术概述
困扰临床诊疗的因素
白血病细胞及微环境异质性强，是困扰临床诊疗的根本因素，肿瘤细胞及微环境细胞高度异质性是白血病的特征之一。肿瘤异质性是指肿瘤在生长过程中，经过多次分裂增殖，其子细胞呈现出分子生物学或基因方面的改变，从而使肿瘤的生长速度、侵袭能力、对药物的敏感性、预后等各方面产生差异。白血病异质性不仅表现在患者间差异显著，而且同一患者的白血病细胞间也差异显著。异质性除了由原先基因组不稳定所致，并在克隆演变中再次变异，最终导致肿瘤对不同抗肿瘤药物的敏感性不同或放疗敏感性的差异。
此外，肿瘤并不是孤立无援的，而是由肿瘤细胞、免疫和炎性细胞、微血管、多种支持细胞（如成纤维细胞、脂肪细胞、胶质细胞、平滑肌细胞等）以及细胞外基质构成的精密“世界”。
在肿瘤的微观世界里，每个肿瘤细胞就像“种子”，而肿瘤细胞的微环境就像“土壤”；种子在土壤的滋润下“生根发芽”并“野蛮生长”。肿瘤微环境又像是高度集成的通信网络，每个细胞都是“基站”，最终构成细胞外通讯及细胞内通讯的动态网络。目前在血液肿瘤上，可利用单细胞转录组等方法深度解析肿瘤微环境各类细胞。研究表明骨髓微环境中多类细胞发生重大改变，最终为血液恶性肿瘤“野蛮生长”提供滋养环境。
临床单细胞精准诊断未来可期
单细胞在多类血液肿瘤的研究中取得了丰硕成果。如美国科学家利用单细胞技术，分析化疗后残留的白血病干细胞自我更新的关键标志物，用于患者预后不良精准判定。在多发性骨髓瘤诊断中，确定导致疾病发生的细胞亚群；分析确定相关信号通路、驱动基因及分化阶段等；并根据诊断结果选择特定的临床治疗方案，从而为多发性骨髓瘤实现个体化治疗提供策略。在骨髓增生异常综合征应用上，利用单细胞基因组测序技术，靶向测序了每例患者大量单细胞的关键突变位点，分析了突变时间和克隆层次，深入解析了骨髓增生异常综合征向髓系白血病转变的遗传学改变，最终制订针对优势克隆的靶向治疗方案。
然而，单细胞技术目前尚未在临床应用中推广。主要受限因素如下：(https://www.daowen.com)
①测序建库实验技术复杂，一般检验人员难以掌握。
②价格昂贵，几千个细胞的测序需花费4万～5万元。
③测序数据量庞大，每例样本具有几百GB数据量，需要大型服务器进行分析。
④数据分析复杂且耗时长，专业背景要求高。
⑤人类细胞类型及亚群大量未知，参考数据目前仍不完备等。
针对上述问题，2017年10月伦敦召开的国际学术会议正式揭开了“建立人类细胞图谱”全球行动计划的序幕。科学家们将利用多种整合单细胞技术，如细胞微流体分离，高通量测序以及全新的标记和染色技术等，完成人类细胞图谱计划。科学家们将通过共同努力，在不久的将来绘制一张正常人的全细胞“地图”，给每个细胞发张“身份证”并详细标注其“家庭住址”。
同时，科学家们在努力开发简单高效的数据分析软件，逐步降低数据分析的难度。在未来，临床医生可以利用软件及人类细胞图谱等，分析每位患者的单细胞数据，通过对肿瘤病灶中每个细胞的身份验证，确定“嫌犯”的来源；进而追溯根源，从源头上遏制肿瘤恶化。另外，人类细胞图谱计划可以同时完成人体多脏器肿瘤微环境中每个细胞的详细参考值（包括细胞类型、数量、定位、关系和分子组成等），记录各种细胞在肿瘤中的“邮政编码”。然后再通过分子分析、空间分析、组织学分析和解剖学分析等工具，重塑3D肿瘤图谱及细胞间的异常通讯关系。
随着国际单细胞图谱计划的推动实施，或许在不久的将来，单细胞技术的普及应用将彻底改变医生和研究人员对疾病的理解、诊断和治疗。
（作者：王 峥）