一篇基于临床标本的论文凭什么可以发表在Blue Jounral
这段时间为了填写两份国家自然科学基金申请书，我将发表在基础医学和呼吸医学主流期刊上与我们医疗和科研有关的文献几乎看了个遍。也就是说，在3月份余下的时间里我基本上无书可读，一时间感到轻微的无所适从。于是我有了兴致写一些回忆过往岁月的文章。今天来了新的话题，便想谈谈刚刚发表在Blue Journal那篇关于结核性胸腔积液（TPE）中Th22细胞免疫学特征的论文（Am J Respir Crit Care Med 2012；185：660-669）的科研设计问题。
我相信这将是一篇能够将我个性发挥到极致的文章。我喜欢现在的工作，经常为自己的工作有起色而长时间感到欢欣乃至狂喜，并希望通过文章的形式延续内心的这份喜悦。你可以将这种别人轻易不使用的方式理解为张扬和幼稚。的确，我有时候也认为自己过于得意，不过我喜欢这样。
这篇文章也可以被认为是针对年轻的临床大夫和研究生开展科研工作的指导性讲座。这里所陈述的内容都是我真实的想法和做法，我从不做作和故弄玄虚，新手应该可以从文章中获得启示。毫无疑问，国内医学界取得辉煌成就的临床医生为数甚众，他们的学术功底我望尘莫及，但他们未必有时间公开以实打实的方式谈论这样的一个话题。
为了便于理解文章内容，建议有兴趣的读者以谦虚的态度向第一作者叶志坚大夫索取电子版原文（higgins.yip@163.com）。这里有个提醒，向他人索取文献或请教技术问题要注意礼节。有些人非常没有礼貌，甚至在电邮中拒绝提供姓名，似乎帮助他们是别人的义务。在此我建议叶大夫，遇此情形无须理会，直接拉黑，我们只与拥有基本教养的人打交道。
本期Blue Journal发表的论著总共只有8篇，可见在国际上最顶端的期刊发表论文真不容易。实际上，来自世界各地的所有投稿每100篇中就有93篇被无情地退稿。美国呼吸科医生当到教授这一级别，如果在一定的时段内能发一两篇Blue Journal论文，就意味着他在自己的地盘站稳了脚跟，不再需要担心饭碗不保。
我们的论文题目不好直译为中文，与英文最接近的表达形式是《结核性胸膜炎中的胸膜间皮细胞可刺激产生白介素-22的辅助性T细胞的分化和募集》。如果同样的内容撰写成为中文，那么我可能会选择这样的题目《Th22细胞在结核性胸膜炎发生机制中的免疫调节作用》。
Th22细胞在结核免疫中的作用早有报道，本文也不是第一次报道TPE中Th22细胞的研究结果。第一篇论文发表于2011年（ESAT-6 and CFP-10-specific Th1，Th22 and Th17 cells in tuberculous pleurisy may contribute to the local immune response against Mycobacterium tuberculosis infection.Scand J Immunol 2011，73：330-337）。所以，就创新性而言，我们的文章并不占优势，之所以还能够发表在本专业最好的期刊上，其原因在于我们的科研设计几近完美，可以说无懈可击。也就是说，我们以清晰的思路和严密的逻辑将一个关于Th22细胞的故事讲得头头是道，引人入胜。
一篇好的基于临床的基础研究论文必须既观察现象又探索机制，否则不可能在好的期刊发表。以Th22论文为例，我们必须首先证实Th22在TPE的存在，然后阐明这些细胞的表型和功能特征及其机制。为此，论文应该具有足够长的篇幅提供尽可能多的信息资料，本文除去附在网络的详细方法（1790字）之外，纸质版的篇幅仍有10页之多，是我们发表过的论文中最长的一篇。
图1 Th22，Th17 and Th1 cells increased in tuberculous pleural effusion要显示的是Th22细胞在TPE的存在。因为已知Th17和Th1细胞与TPE密切相关，研究资料比较多，所以按照常规应该将这两者作为参照一并安排在图1中，这是科学论文的常规思路和做法。除了提供所有病例的Th22、Th17和Th1细胞数量，按惯例还必须提供所用检测方法的典型结果图，如流式细胞仪、免疫组化或者RT-PCR的电泳条带等。
必须指出的是，正常人没有可以用于研究的胸水，我们不必考虑设置所谓的正常对照组。恶性胸水与TPE属于完全不一样的疾病，两者不具备可比性，所以也不宜纳入本研究。唯一可以作为对照的只能是TPE患者自身的外周血。
图2 Phenotypic characteristics of Th 22 in tuberculous pleural effusion在图1的基础上进一步阐述TPE中Th22细胞的表型特征，要显示这些细胞到底是记忆T细胞还是效应T细胞。图3 Chemokine receptors expressed on Th22 cells实际上是图2的补充和扩展，因为趋化因子的表达同样属于细胞表型的范畴。图2资料更大的重要意义在于为随后研究Th22的趋化效应作前期准备。本文提供的信息量尽管超大，但一环扣一环，逻辑性极强，决不会给人堆砌和凌乱的印象。
图4 Differentiation of human Th22 cells from native CD4+T cells stimulated by different cytokines是本文的第二场重头戏。图2和图3是图1的扩展，而图4则是图1的纵深升华。既然知道了TPE中的Th22细胞数量显著增多，那么就有必要了解其增多的机制，图4要回答的正是这样的一个大问题。我们以前的系列论文先后报道了TPE中有多种炎性细胞因子水平明显高于外周血，提示这些细胞因子有可能影响胸腔局部Th22细胞的发生、分化和增殖。基于这些假设而发掘的全新的发现全部展现在图4之中。
图5 Chemokines in tuberculous pleural effusion were chemotactic for Th22 cells从另外一个角度探讨Th22细胞增多的机制。既然TPE中趋化因子CCL20、CCL22和CCL27浓度明显升高，而TPE和外周血中的Th22细胞表面都表达相应的趋化因子受体CCRs，提示这些趋化因子具有将Th22细胞动员进入胸膜腔的能力。图5提供必要的证据显示TPE中高浓度的趋化因子通过与外周血Th22表面的CCRs相结合从而动员这些细胞浸润到胸腔。
(https://www.daowen.com)
Figure 1 IL-22-producing helper T(Th22),Th17,and Th1 cells increased in tuberculous pleural effusion(TPE).(A)Th22,Th17,and/or Th1 cells within CD4+T cells were identified on the basis of their expression of CD3 and not of CD8.(B)Representative flow cytometric dot plots of isotype control,Th22,Th17,and Th1 cells in TPE and blood.(C)Comparisons of percentages of Th22,Th17,and Th1 cells in TPE and blood(n=28).Horizontal bars indicate means±SD.The percentages of Th22,Th17,and Th1 cells were determined by flow cytometry,and comparisons were made by Wilcoxon signed-rank test.(D)Th22 cells correlated positively with Th17 and Th1 cells in TPE(n=28).Correlations were determined by Spearman rank correlation coefficients.
Figure 2 Phenotypic characteristics of IL-22-producing helper T(Th22)cells in tuberculous pleural effusion(TPE).(A)Representative flow cytometric dot plots show the expression of IL-22 and CD45RO,CD45RA,CD62L,and CCR7 on CD4+T cells.(B)Summary data of percentages of CD45RO+Th22,CD45RA+Th22,CD62L+Th22,and CCR7+Th22 cells in TPE and blood from patients with TPE(n=28).Horizontal bars indicate means±SD;comparisons were made by Wilcoxon signed-rank test.
Figure 3 Chemokine receptors expressed on IL-22-producing helper T(Th22)cells.(A)Representative flow cytometric dot plots of CCR2,CCR3,CCR4,CCR5,CCR6,and CCR10 expression on Th22 cells from tuberculous pleural effusion(TPE)and blood.(B)Comparisons of percentages of CCR2+Th22,CCR3+Th22,CCR4+Th22,CCR5+Th22,CCR6+Th22,and CCR10+Th22 cells in TPE and blood from patients with TPE(n=28).Horizontal bars indicate means±SD;comparisons were made by Wilcoxon signed-rank test.
在弄清TPE中Th22细胞增多的机制之后，接下来就该想办法知道Th22细胞在TPE到底有些什么样的免疫功能。图6 Effects of IL-22，IL-17 and IFN-γon wound healing of in vitro injury model of pleural mesothelial cells、图7 Effects of IL-22，IL-17 and IFN-γon wound healing and proliferation of pleural mesothelial cells，以及图8 Effects of IL-22，IL-17 and IFN-γon long-term restoring of pleural mesothelial cells就是要显示TPE中Th22细胞的免疫学功能特征，重点探讨它们对胸膜间皮细胞急性损伤、损伤修复及增殖反应的影响。我们发现Th22细胞和Th17细胞的功能有一定的重叠，但与Th1细胞完全不一样。这些认识都是新的发现，相信也是本文比同类论文更高一筹的亮点所在，能够打动审稿人和总编辑也就不足为奇了。
Figure 4 Differentiation of human IL-22-producing helper T(Th22)cells from naive CD4+T cells stimulated by various cytokines.(A)Purified naive CD4+T cells isolated from tuberculous pleural effusion(TPE)and blood were stimulated with plate-bound anti-CD3 and soluble anti-CD28 monoclonal antibodies(mAbs)in the presence of the designated cytokines,either alone or in various combinations.Seven days after activation,the cells were restimulated with phorbol myristate acetate and ionomycin for 5 hours and analyzed for IL-22 expression after intracellular staining.Results are reported as means and SEM from five independent experiments.Comparisons were detemined by Kruskal-Wallis one-way analysis of variance on ranks.*P<0.05 compared with medium control.Carboxy fluorescein succinimidyl ester(CFSE)-labeled naive CD4+T cells were cultured and stimulated with plate-bound anti-CD3 and soluble anti-CD28 mAbs in the absence(left)or presence(right)of IL-6 plus tumor necrosis factor(TNF)-αfor 7 days,and CFSE+(B)T cells and(C)Th22 cells were then analyzed by flow cytometry.The representative dot plots gated on CD4+T cells are from one of five independent experiments.
尽管上述各图都重要，缺一不可，但本文最重要的新东西则主要集中在图9 In vitro stimulation of CD4+T cell proliferation by antigen presentation of pleural mesothelial cells和图10 In vitro stimulation of Th22，Th17，and Th1 cell differentiation by antigen presentation of pleural mesothelial cells。前者在国际上首次报道了胸膜间皮细胞具有呈递抗原的能力，并通过呈递抗原信息促进CD4细胞增殖；后者则进一步显示胸膜间皮细胞呈递抗原的结果是刺激Th22、Th17和Th1细胞的发生和分化。同样重要的是，这两幅图提供的资料成为说明Th22细胞增多的第三种机制，亦即胸膜间皮细胞可以刺激Th22细胞的扩增，这是在此之前无人知道的新知识。
综上所述，可以看出一篇好文章不一定在于是否第一次观察某一个特定的研究对象，好的期刊更看重科研设计的完善。作者必须提供详尽可靠的实验依据来论证自己的假设，在此基础上提出新的观点，最终达到更新或者修正所在领域原有认识的目的。更重要的是，作者提出的每一个观点都必须基于自身的资料，而不能依靠引用他人的报道来推测可能的关系。也就是说，你的结果和结论必须存在直接的因果关系，不能依靠推理。本文完全满足了这些最基本的要求，因而是一篇非常优秀的论文。
应该注意到，引用他人文献的目的一方面在于介绍背景资料，在对比中展示自己工作的创新性；另一方面则为将自己的实验结果进行理论化作铺垫。但所有这些本质上都只能是起到衬托作用，不能作为下一个新结论的依据，因为那不是你的东西。
完成一篇优秀的科学论文需要长期积累，依赖于良好的学术沉淀。我们都是普通的临床医生，重要的是要准确把握自己的定位，我们不太可能作出惊人的原创性重大科研成果。我个人认为，一个医生能够在自己所在专业最顶尖的学术期刊发表论文，本身已经是一件很好的事情。在日常医疗工作中就自己感兴趣的问题进行思考，对不明白的地方收集证据来解答自己的疑惑，这就是科研的核心价值所在。
发表论文极端重要，因为论文是展示基础和临床研究结果最主要的形式，也是医学研究造福人类的起步阶段。但是，为了发表论文而处心积虑地寻找“切入点”或者“突破点”不会有真正的建树，不可能得到国内外同行的真心认可和赞许。那样做的结果，充其量只能是生产几篇可以评工计分的SCI论文。
优秀论文需要花费时间，需要花费心血，需要很多人默默地长时间埋首于病房和实验室静心工作。我们上一次发表这样的论文发生于七年前（Am J Respir Crit Care Med 2005；172：1434-1439），老实说，我现在也说不准下一次在Blue Journal发表论文该轮到什么年份，真的很不容易。（2012年3月15日）