支气管肺泡灌洗液实验室检查

四、支气管肺泡灌洗液实验室检查

送检BALF须达到规定的回收比例，要求回收率30%以上，且细胞组分中红细胞数＜10%，以尽可能准确反映病变局部的真实情况，并避免血液污染干扰检查结果判断。肺泡灌洗液按实验室要求送达实验室后，可开展多种项目检查，多角度辅助临床进行诊断和鉴别诊断、评估病情和评价疗效。不同疾病的患者，临床申请的BALF检查可有不同，临床常规可检查内容主要包括微生物涂片染色、培养检查和耐药鉴定，微生物的核酸检测，半乳甘露聚糖（GM）和（1， 3）—β—D—葡聚糖（G）检测，细胞形态学检查等。

■（一）BALF标本的处理

常规工作中首先对采集到的BALF进行细胞组分与非细胞组分的分离，常用的分离方法有细胞离心机（Cytospin）制作、试管离心（常规）、微孔纤维滤膜法、盖玻片法、流式细胞仪分类法。大多数处理方法是将所有样品集中起来，仔细混合后，将液体通过单层纱布过滤去除黏液。这种过滤对细胞含量几乎没有影响，总计数保持恒定，淋巴细胞和中性粒细胞分类计数不变。但2017年《共识》认为：对获取的BALF，特别是含有黏液成分时，不需要常规过滤，因为在过滤过程中，细胞会黏附于纱布，损失部分细胞及其他成分，如肺孢子菌更多地存在于黏液成分中，过滤过程会使标本的稳定性受到影响，且存在污染的可能性。本中心在常规检查中通常不进行纱布过滤，如遇黏液则挑出，通过压拉涂片法，染色镜检，经常有重要发现，尤其是检出肺孢子菌和嗜酸性粒细胞等，或采用DTT溶解黏液后，再行常规细胞学检查。BALF 800～1 500 r/min，离心5～10 min后，上清液可即时或在—20℃或—80℃下冷冻后用于非细胞含量分析，沉淀物用于显微镜检查。另外，通过0.45～1.2 μm的Millipore膜对基本的BALF进行真空过滤后，可进行石棉体的定量测定。

■（二）BALF细胞形态学检查

细胞形态学分析标本应选择硅化的塑料容器或玻璃容器以减少细胞的黏附。

1.细胞计数 细胞计数在Neubauer细胞计数板或自动检查系统中进行。在显微镜低倍或高倍镜下时，计数除上皮细胞以外的所有细胞，以每升回收液的细胞数表示。必要时，以锥虫蓝（又称台盼蓝）检测细胞的活力，通常活力＞80%可以满足临床检查需求。

2.细胞形态学检查及分类 可以使用简单的涂片和离心机或微孔过滤，涂片对于肿瘤细胞鉴定更好。当BALF呈血性时，离心过程中炎性细胞可被大量红细胞遮蔽，制片采用推片更好。常规染色采用瑞—吉染色或迈格吉（May-Grunwald-Giemsa，MGG）染色。形态学检查需要对常见细胞组分进行计数分类（表1—1），并根据医嘱对全片查找异常肿瘤细胞、微生物病原体、寄生虫等，应报告观察到的噬菌细胞、中性粒细胞中毒性改变、蛋白沉积的无定形颗粒等现象，以辅助临床进行病情评估。应存储至少三张未染色的片子，在有临床指征或瑞—吉染色提示异常时，可以进一步行铁、糖原、六胺银、甲苯胺蓝、脂肪或抗酸等染色。

根据BALF观察到的肺部肿瘤细胞形态不同，可辅助区分肺癌的不同病理类型。

（1）腺癌：典型的腺癌细胞，呈腺腔样、乳头状排列；细胞大小较一致，形态圆形或椭圆形；胞质丰富，胞质嗜碱性或弱嗜酸性，常含有云雾样囊性黏液空泡；胞核大小不一，染色深；核仁常可见，核膜较清晰。

（2）鳞癌：① 高分化角化型鳞癌细胞：单个散在，也可多个细胞相拥形成癌珠，形态大小不一，有的胞体大，具多形性，胞质角化，嗜酸性染色，核质比不高，核固缩、深染，核仁少见。若是中央坏死的空洞型病变，尚可见坏死背景。② 非角化型鳞癌细胞：细胞松散或聚集，圆形、多角形；胞质均匀深染并呈嗜碱性，胞界不清；胞核居中、异型，明显不规则，可见突出的核仁，染色质粗大深染、分布不均。

（3）小细胞癌：① 大细胞型未分化癌细胞：中等大小，呈不规则圆形、卵圆形；胞质量中等或较少，嗜碱性染色；核圆形或不规则形，位于细胞中央，染色质粗糙，分布不均，着色深。② 小细胞未分化癌细胞：体积小，胞质量少，可呈裸核样；核大，畸形，可见圆形、卵圆形、三角形或其他不规则性；核染色质粗糙，着色深；常密集成团，有镶嵌现象，其中燕麦癌是小细胞癌一亚型，细胞核呈典型瓜子形。

（4）大细胞癌，较为罕见，临床送检标本确诊病例少，笔者尚缺少相关经验体会。

3.BALF形态学报告 建议应该包括细胞总数、有核细胞总数、细胞分类计数百分比、细胞形态学检查发现（包括筛查肿瘤细胞、巨噬细胞内容物、巨细胞病毒内含物、耶氏肺孢子菌、真菌、细菌、发育异常上皮细胞和浆细胞等，图文最佳）、任何其他值得记录的结果、检查结论或者检验诊断。可能情况下，记录灌洗的肺段和灌洗液量（需临床申请检查时提供），详见本书第二章。

■（三）BALF标本的微生物学检查

1.微生物培养及耐药检测 BALF细菌培养、鉴定和药敏试验是肺部感染诊断和鉴别诊断、指导临床用药的重要检查措施。BALF是直接对病灶收集的分泌物进行细菌培养和药敏试验，避免了上呼吸道细菌的污染，因而可以准确地诊断病原菌，具有直接、无创、敏感等特点。不同人群肺部感染其主要致病微生物可有不同，临床上引起肺部感染的病原主要包括细菌、真菌、支原体、病毒、结核分枝杆菌等。用于病原学分析的BALF标本需用无菌容器收集。微生物标本送检时限要求较高，检测方法不一，建议按2017年《共识》的要求严格送检，以保证足够高的病原检出率（表1—2）。

（1）一般细菌培养：无菌操作下采集的BALF进行直接接种培养或取其沉淀物进行培养，对检测细菌及真菌具有较大的临床意义，BALF细菌培养计数≥104 CFU/ml或防污染BALF≥103 CFU/ml时具有临床诊断意义，但不能机械使用该阈值，还要结合患者的实际情况及有无使用抗菌药物等因素综合判断。对于检验前用过抗生素的患者应采用较通常低10倍的阈值作为标准。细菌培养阳性可进行耐药检测。

（2）真菌培养：BALF标本1 500～1 800 g离心15～20 min，沉淀物混匀后接种于沙保弱琼脂平板28℃和念珠菌平板35℃孵育7天，怀疑双相真菌时应使用带螺帽的培养基孵育6周。

（3）特殊病原菌培养：BALF离心后的沉淀物还可用于分枝杆菌、军团菌及病毒等的培养。多种检查方法的联合应用可以大大提高BALF对病原微生物的检出率。(https://www.daowen.com)

2.涂片微生物染色镜检

（1）革兰染色：建议使用细胞离心机制片，取适量BALF标本600～1 000 r/min离心10～20 min，制片干燥后，进行革兰染色。观察染色结果及白细胞情况，如果见到噬菌现象需报告吞噬细菌的中性粒细胞占全部中性粒细胞的比例，通常数值为5%时可作为肺炎诊断的阈值。

（2）抗酸染色：用于检查分枝杆菌，弱抗酸染色可用于检查奴卡菌。

（3）六胺银染色：常用于肺孢子菌的检查。

（4）墨汁染色：用于隐球菌的检查。

（5）免疫荧光染色：可用于军团菌、肺孢子菌及病毒的检查。

（6）氢氧化钾（KOH）压片：用于真菌，特别是丝状真菌的形态学观察。

3.GM试验和G试验测定 GM是曲霉菌细胞壁的多糖组分，在真菌菌丝侵袭组织的过程中真菌细胞壁的多糖组分GM被释放出来，其在体液中较易被检查到，并在临床或放射学征象出现之前就能检查到。对于早期快速诊断侵袭性肺曲霉病，特别是气道曲霉感染的患者具有重要的临床价值。作为非培养检查手段诊断侵袭性肺曲霉病，BALF—GM已被列入IDSA和EORTC/MSG推荐的诊断标准之一。但在临床诊治工作中，不能仅凭BALF—GM的结果进行抗真菌治疗，需要结合临床资料及影像学表现等进行综合分析，来判断阳性结果的意义。

G是一种存在于真菌细胞壁中的物质，当真菌侵入机体时真菌细胞壁中的G大量释放，使血液或其他体液中G含量升高。G试验可用于广谱真菌感染诊断，但无法区分曲霉与酵母菌感染，结果易受到白蛋白、磺胺类或一些细菌感染的影响，可能造成假阳性。肺部真菌感染早期，（1， 3）—β—D—葡聚糖未进入血液中，导致早期血清G试验无法检测到。另外，肺泡灌洗液G试验易受口咽部真菌定植影响，诊断的准确性有偏差，同样存在假阳性的可能。因此，临床常用GM试验和G试验联合检测，其灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确度可分别达到90.0%、93.3%、93.1%、93.3%和91.0%，可以尽量避免漏诊情况的发生，弥补了单项检测的缺点。

4.核酸检测 细菌、病毒、军团菌、真菌、分枝杆菌、衣原体、支原体及寄生虫等还可以通过BALF中的核酸测定进行诊断。许多分子检测技术有高度的敏感性和特异性，如PCR和杂交技术。BALF中的PCR方法对肺孢子菌肺炎的诊断具有较高的敏感性和特异性。近年来二代测序技术应用于检测肺部的菌群，大大提高了肺部疾病的研究和临床检测诊断能力。值得注意的是，核酸诊断的结果应与患者的临床信息和传统检测结果同时进行综合分析和解释，才能更好地反映患者真实的临床情况。

■（四）BALF非细胞组分检测

健康人BALF中存在其他多种可溶性成分，既往文献中相关检测项目及可参考的具体数值见表1—3。但必须认识到这些非细胞成分的参考值范围是动态的，与支气管灌洗操作、灌洗液回收率、血液污染、实验室标本处理步骤、不同检测试剂盒及操作人员误差等多种因素相关，且部分相关文献过于陈旧，如果开展相关项目检测，必须建立各单位实验体系自己的参考值范围，并结合患者、标本具体的临床情况综合判断。一些常见影响检测结果的因素包括：① 解剖定位的不确定性（肺泡/支气管）；② 任何物质来源的不确定性（被动或主动从血浆或灌洗部位产生）；③ 灌洗盐水对肺泡液进行未知稀释；④ 灌洗期间毛细血管与肺泡液体运动的不确定性。非细胞组分定量衡量单位可以应用不同溶质浓度表达，通常以每毫升BALF回收液表示（表1—3）。

■（五）BALF流式细胞术和DNA倍体分析

1.细胞表面分子和胞内细胞因子检测 对于白血病和淋巴瘤细胞肺部浸润，可以利用流式细胞术对细胞表面特异性免疫分子检测，进行肿瘤细胞的诊断和分型，特定淋巴细胞亚群可以通过胞内细胞因子进行检测。

2.倍体异常的DNA定量分析 DNA定量分析法是通过对细胞DNA进行特异染色（Feulgen染色）后于显微镜下行图像定量分析，其优点是实现了细胞学检查的自动化诊断、标准化和数字化，具有可重复性强、对诊断灵敏度高等优点，能够比病理学诊断提早15个月诊断恶性肿瘤；其缺点是不能诊断出肿瘤类型及分化高低。标本数量少、取材不佳致细胞过少、取材没有取到病变组织均会导致假阴性诊断。DNA定量分析的假阳性结果有可能由细胞反应性增生或受病毒、真菌等感染引起。DNA定量分析结论分3种：第1种为未见DNA倍体异常细胞；第2种为少量DNA倍体异常细胞（1～2个细胞DNA指数≥2.5）；第3种为大量DNA倍体异常细胞（3个及以上细胞DNA指数≥2.5）。针对368例肺部肿瘤患者进行支气管镜刷检及肺泡灌洗液细胞DNA定量分析和液基细胞学诊断相关性研究，结果表明肺泡灌洗液细胞DNA定量分析的灵敏度、特异度分别为85.8%和78.9%，阳性预测值为82.4%。BALF DNA定量分析的灵敏度、特异度高于液基细胞学，两者联合应用有助于提高恶性肿瘤的检出率，降低漏诊和误诊的风险。