一、组织切片技术
（一）组织的脱水、透明、浸蜡
1.脱水
组织经固定和水洗后含大量水分，与二甲苯、石蜡等不能相溶，故在浸蜡、包埋前必须脱水，将组织中的水分利用脱水剂置换出来，使有机溶剂能更好地渗入组织，为后续工作打好基础。组织脱水之前必须将固定好的组织充分水洗，特别是需要做免疫组织化学实验的组织更需要彻底水洗，因为福尔马林会影响组织内抗原的保存；水洗和脱水不充分容易引起脱片和染色不鲜亮，制作出的蜡块会出现凹陷；过度脱水会造成组织过脆，切片困难。常用的脱水剂有：乙醇、丙酮、异丙醇、正丁醇、叔丁醇、松脂醇等。
影响脱水结果的因素有：脱水时间、脱水剂的浓度、组织来源及大小、脱水设备所在环境的温度等。乙醇因具有易溶于水、脱水力强、价格低等优点，现为较常用的脱水剂。为避免纯乙醇脱水造成组织过度收缩，所以乙醇的脱水要从低浓度开始，逐步将组织中的水分脱出。由于低浓度乙醇更容易将水从组织中脱出，故低浓度乙醇使用时间较高浓度乙醇要短。大的组织比小的组织所需脱水时间要长；脂肪和疏松结缔组织要延长脱水时间；致密结缔组织特别是子宫肌瘤脱水时间要缩短；同样大小的动物组织比人体组织时间要短。脱水剂使用一段时间后要按照使用情况更换，一般为脱水剂800mL/缸脱500块组织后更换一次。脱水设备所在环境温度低于18℃时需要延长脱水时间，高于22℃时需要缩短脱水时间。具体过程详见表1.2.2-1、表1.2.2-2。
2.透明（媒浸）
组织脱水后通过一种既能与乙醇混合又能溶解石蜡的有机溶剂使组织中的乙醇被该溶剂取代并能帮助石蜡浸入组织。因该有机溶剂的折光度接近组织蛋白，从而使组织变得透亮。常用的透明剂有：二甲苯、苯、氯仿、四氯化碳、甲苯酸甲酯等。这些有机溶剂易挥发、易燃、有毒，使用时应注意安全及通风。透明需要经过2～3次，这样才能将组织中的乙醇被完全脱出。具体过程详见表1.2.2-1、表1.2.2-2。
3.浸蜡
将透明后的组织浸入熔好的石蜡内称为浸蜡，使用其他浸透剂（如火棉胶、碳蜡、明胶等）浸入组织称为浸透。通常需要浸入2～3次石蜡才能使浸蜡完全，浸蜡的温度不能过高，时间不宜过长，否则会引起组织脆硬，切片不成形；时间过短会使组织浸蜡不充分，不易包埋切片。浸蜡温度以56℃为宜，现多采用自动脱水机，浸蜡温度恒定，效果较好。具体过程详见表1.2.2-1、表1.2.2-2。
表1.2.2-1 人工脱水、透明、浸蜡程序和时间
*人体组织块、动物组织块厚度为2～4mm。
RT（room temperature）：室温。
表1.2.2-2 自动脱水机处理程序和时间
*80%甲醛乙醇溶液配制方法为：80mL甲醛原液和720mL80%酒精溶液混合。
RT（room temperature）：室温。
（二）组织包埋法
将处理好的组织放入熔好的包埋剂中称为包埋。组织包埋法有常规石蜡包埋法、快速石蜡包埋法、火棉胶包埋法、石蜡半薄切片包埋法、树脂包埋法、碳蜡包埋法、松脂醇包埋法等。这里介绍的是最为常用的常规石蜡包埋法。
常规石蜡包埋法最常选用熔点在58～60℃的石蜡，使用前需要过滤掉石蜡中的杂质并要多次熔化和冷却使其密度增加便于使用，密度低的石蜡容易在切片时碎裂。将熔好的石蜡倒入包埋框内，将组织块用烫好的镊子放入，并用镊子将组织轻轻压平；放入的组织温度应和包埋石蜡温度相同，否则会出现组织与蜡块分离的现象，从而影响切片；包埋时需注意先清除混杂于组织内的线头、金属夹、纸等杂物。石蜡温度应控制在70℃左右，温度过高会烫伤组织。包埋时要注意包埋面，一般的组织块选择平整、较大的一面作为包埋面。囊（肿）壁、血管、消化道、皮肤及宫颈要竖起包埋，使各层组织都能暴露。多块小组织要包埋到一个面上，穿刺组织要压平使整条组织处于一个平面上。破碎的组织（如宫内膜）要平摊包埋。
（三）常用的组织切片法
组织切片法很多，这里介绍的是常用的2种切片方法。
1.石蜡切片法
（1）切片前准备
①包埋好的蜡块在切片前要先粗修，即将组织块最大面充分暴露，小组织粗修时要小心不要修得太多，将粗修好的蜡块在冰箱内或冷冻台上冷冻15min左右；
②检查切片刀是否锋利，刀片、刀架、刀座是否固定好，使刀刃与蜡块表面呈5°夹角，调整好切片机切片厚度（3～5μm）；(https://www.daowen.com)
③准备好初步展片用的低浓度乙醇（浓度为20%～30%）和展片用的温水（40～47℃），准备好毛笔、小弯镊、铅笔、干净载玻片等。
（2）轮转式切片机制作切片的方法
①固定好蜡块后，右手轻柔且匀速旋转转轮，左手持毛笔，用毛笔轻轻托起、拉展切出的蜡片；右手拿小弯镊夹住蜡片，左手用毛笔清扫蜡片与刀片接触部，注意不要让毛笔扫在刀口上磨损刀口；
②纤维、肌肉走向要与刀片平行，皮肤组织切片时应将表皮面向上，消化道组织切片时要将浆膜面向上，肿瘤组织切片时包膜面向上；
③先切较软的组织再切骨组织、钙化组织；
④刀锋不利、切片太厚会引起切片上卷；蜡块固定不好会引起切片起皱纹；刀片有缺口、蜡块内有杂物会引起切片断裂和不完整；刀片与蜡块不平行、刀锋不均匀会引起切片弯曲。
（3）展片、捞片、烤片
①将切好的蜡片正面向上放入低浓度乙醇内初展片，再用载玻片捞起放入温水中展平捞起放于载玻片中下1/3处；
②乙醇浓度过高、水温过高会使蜡片破碎；
③捞好的切片在空气中略干燥后放在摊片机上烤片10min后，放入65℃烤箱内烤片20min后即可进行脱蜡、染色，烤片的目的是让组织与载玻片紧密黏附；
④捞好的切片上残存有较多水分，必须经干燥后再烤片，直接烤片会产生气泡，导致脱片，也可将切片捞好后先用力甩几下再干燥、烤片；
⑤脂肪组织切片、大脑组织切片、凝血块切片、皮肤组织切片、尸检块切片、宫内膜组织切片等的烤片时间应略长，烤片温度过高会导致细胞收缩。
（4）切片机的维护
切片刀放置的倾角为20°～30°，倾角过大可导致切片上卷，不能连续切片等；倾角过小会引起切片皱起。螺丝松动会引起切片薄厚不均。
2.冰冻切片法
冰冻切片多用于手术中诊断，为外科医生制定手术方案提供可靠依据；由于冰冻切片对组织抗原保存较好，特别适用于肾脏穿刺组织的免疫荧光检查；冰冻切片不经过乙醇脱水和二甲苯透明，对脂肪和类脂的保存完好，便于进行脂肪染色和神经组织髓鞘染色；固定剂、脱水剂等有机溶剂均对酶活性有影响，故冰冻切片还适用于酶类染色来研究生物体内细胞形态、代谢和功能的关系。
（1）将冰冻切片机预制冷使刀头处温度恒定于-25℃左右，所用毛笔也需放在冷冻舱内降温。
（2）将标本的包埋面向上放在冷冻头上用包埋剂（OCT或普通胶水）包埋、速冻。速冻可放在冻台上或放入液氮中速冻。组织必须速冻，不然会产生冰晶影响组织形态。
（3）组织冻好后将冷冻头固定好，调整好组织与刀片之间的位置进行粗修，用毛笔清理碎屑，放下抗卷板开始细切，切片厚度为4～8μm。将切好的切片黏附于载玻片上后固定、染色。
（4）冰冻组织固定可根据染色方法不同选用10%福尔马林、95%乙醇、甲醇-冰醋酸液（97mL甲醇+3mL冰醋酸）、丙酮等。
（四）骨组织和含钙组织脱钙法
骨、牙齿和钙化组织在脱水前除需要充分固定外应进行脱钙处理，否则无法制片，脱钙组织厚度不宜超过4mm。常用脱钙液为10%甲醛90mL与浓硝酸10mL的混合液，脱钙时间为1～2天，理想的脱钙效果表现为针刺组织无阻力；脱钙后的组织需用流水冲洗15～30min再进行脱水。