常用的特殊染色方法
组织的特殊染色是利用组织和染料之间的物理作用（包括毛细现象、吸附作用、吸收作用等）及化学作用（包括离子键、离子交换、共价键、氢键等）使二者结合，表现为特定组织与特定染料之间的亲和性；在染料分子中有使组织产生颜色的发色团和使染料颜色加深并与组织产生亲和力的组色团，在镜下表现为不同的颜色，从而得以区分辨别。
（一）结缔组织染色方法
结缔组织（connective tissue）广泛存在于人体和动物体内，由少量的细胞和较多的细胞间质纤维和基质构成，其主要化学成分是蛋白质和多糖。结缔组织主要包括固有结缔组织、软骨组织和骨组织。
1.结缔组织复合染色法
（1）Masson三色染色法
①染色步骤为Mayer氏苏木素10min，水洗1min，分化，水洗，返蓝，水洗→丽春红-酸性复红染液5～10min→水洗→1%磷钼酸3min，不水洗→亮绿（天青石蓝染液）3～5min→水洗（也可不洗）→0.2%冰醋酸冲洗数秒→95%乙醇数秒→无水乙醇脱水→透明封固。
②亮绿或天青石蓝将胶原纤维染成绿色（如为天青石蓝染色则为蓝色）；酸性品红、丽春红将肌纤维、细胞质染成红色，红细胞呈橘红色；苏木素将细胞核染成蓝色。
③肾脏染色时，基底膜被亮绿（或天青石蓝）染成绿色或蓝色；嗜复红蛋白被酸性品红和丽春红染成红色。
④Masson三色染色受室温影响较大，必要时需要水浴染色，染色不满意时可在冰醋酸内脱色后重新染色；注意更新染液。染色效果如图1.2.2-2所示（见彩插）。
（2）Mallory三色染色法
①染色步骤为重铬酸钾液10min，水洗，蒸馏水洗1min→酸性复红液2min，蒸馏水稍洗→苯胺蓝液20min，95%乙醇分化，无水乙醇脱水，透明封固。
②苯胺蓝将胶原纤维和网状纤维染成蓝色，并将软骨、黏液、淀粉样变物质染成淡蓝色。
③酸性复红将神经胶原纤维、肌纤维和酸性颗粒染成红色，将髓鞘和红细胞染成橘红色。
④染色不满意时可在95%乙醇、冰醋酸内脱色后重新染色；注意更新染液。
2.胶原纤维（collagen fiber）染色法
（1）天狼星红（sirius red）饱和苦味酸染色法
①染色步骤为苏木素复染3min，水洗，分化，水洗，返蓝，水洗→天青石蓝染液5～10min，蒸馏水洗3次→天狼星红饱和苦味酸染液15～30min→不洗，无水乙醇分化、脱水，透明，封固。
②天狼星红将胶原纤维染成红色；天青石蓝将细胞核染成绿色；苦味酸将其他染成黄色。
③封片后要及时在偏光显微镜下观察，其中Ⅰ型胶原纤维排列紧密显示很强的双折光性，呈橙黄色或红色；Ⅱ型胶原纤维显示弱的双折光性，呈多色彩疏松网状分布；Ⅲ型胶原纤维显示弱的双折光性，呈绿色细纤维；Ⅳ型胶原纤维显示弱的双折光性，呈淡黄色。
（2）Van Gieson染色法
①染色步骤为铁苏木素10～20min，水洗，盐酸-乙醇液分化，水洗，蒸馏水洗→VG染液3～5min，倾去染液，不洗，95%乙醇分化，脱水，透明，封固。
②酸性复红将胶原纤维染成红色；苦味酸将肌纤维、细胞质及红细胞染成黄色；苏木素将细胞核染成蓝褐色。
③VG染液不能久存，需要现用现配，95%乙醇分化时要快，否则容易脱色。
3.网状纤维（reticular fiber）染色法
网状纤维组织的蛋白质可与银化合物结合，经过甲醛还原成为金属银沉淀于组织内及表面，用银氨溶液浸染能使其变成黑色，故又将网状纤维称为嗜银纤维（argentaffin fiber）。
（1）Gomori银染法
①染色步骤为高锰酸钾氧化液5min，水洗1min，2%草酸2min，水洗，2%硫酸铁胺2min，水洗，蒸馏水洗2次，银氨溶液1min，蒸馏水洗2次，20%甲醛5min，蒸馏水洗2次，0.2%氯化金调色1min（镜下控制），蒸馏水洗2次，丽春红苦味酸液3～5min，倾去染液，直接用无水乙醇脱水，透明，封固。
②银将网状纤维染成黑色；丽春红将胶原纤维染成红色；苦味酸将背景染成黄色。
③银氨溶液配制容器要化学纯净，滴加氨水不能过量，配好后应低温保存。
（2）网状纤维染色诊断学应用
①鉴别癌与肉瘤；
②区分血管内皮瘤与血管外皮瘤；
③鉴别淋巴细胞肉瘤与网状细胞瘤；
④区分骨尤文肉瘤与骨网状细胞瘤；
⑤显示与鉴别骨异质增生与骨化性纤维瘤；
⑥观察组织中基底膜的变化；
⑦鉴别脑膜瘤与星形细胞瘤。
（二）肌肉组织染色方法
1.横纹肌染色法（Mallory磷钨酸苏木素染色法，即PTAH）
（1）染色步骤
①高锰酸钾氧化液5～10min，水洗，草酸漂白，水洗，蒸馏水洗（或5%硫酸铁胺30min）。
②PTAH液12～48h（或60℃温箱1h）。
③95%乙醇分化，无水乙醇脱水，透明，封固。
（2）苏木素与组织有选择地结合，形成不溶性的蓝色沉淀，显示为棕色和蓝色两种不同的结果。细胞核、纤维、肌肉、神经胶原纤维、纤维素、横纹肌呈蓝色；胶原纤维、网状纤维、软骨基质及骨呈黄色或玫红色；粗弹性纤维呈微紫色；有缺血缺氧早期病变的心肌呈紫蓝色或棕黄色；粗弹性纤维有时被染成微紫色。
2.缺氧心肌染色法（Nagar Olsen染色法，即HBFP）
（1）染色步骤
①苏木素3～5min，水洗，分化，水洗，返蓝，水洗，蒸馏水洗。
②碱性复红液3min，蒸馏水洗，纯丙酮5s。
③苦味酸纯丙酮液分化，纯丙酮脱水，透明，封固。
④乙醇脱水，透明，封固。
（2）缺氧心肌对酸性复红的亲和力称为嗜复红性，对碱性复红的亲和力称为亲复红性。缺氧心肌、红细胞呈红色；正常心肌呈黄色；细胞核呈蓝色。缺氧心肌对复红着色慢但分化脱色也慢，而分化液对正常心肌作用力强。
（三）糖类（carbohydrates）染色
糖类分为多糖（polysaccharides）、中性黏液物质（neutral mucosubstances）和酸性黏液物质（acid mucosubstances），这些物质经过酸的氧化物再与染色剂结合能被清晰显示。
1.糖原染色
多糖分子是以苷键结合成大分子的化合物，多糖分为淀粉、纤维素和糖原。正常人和动物体内的肝脏、心肌和骨骼肌的细胞质内含有大量的糖原；毛囊、子宫腺体、阴道上皮及脐带也有少量分布。由于糖原在机体组织死亡后很快分解为葡萄糖，所以必须及时取新鲜组织用特殊固定液（Gendre、AFF、Carnoy固定液）保存糖原。
（1）染色步骤
蒸馏水洗，高碘酸氧化液5～10min，蒸馏水洗，Schiff染液10min，水洗，苏木素复染，分化，水洗至细胞核变蓝，无水乙醇脱水，透明，封固。
（2）染色原理(https://www.daowen.com)
①高碘酸是一种氧化剂，它可以把多糖的葡萄糖分子的两相邻的带有羟基的―C—C―打开而生成醛基再与染色剂结合。
②碱性复红经亚硫酸和二氧化硫的作用，醌式结构的双键被破坏而消失，成为无色复红，在经过氧化后的醛基与无色复红液进行结合呈紫红色。
（3）染色结果
糖原及其他PAS反应阳性物质（见表1.2.2-3）呈红色，细胞核呈蓝色。
2.黏液物质（黏多糖）染色
人体和动物体内各种腺体及许多器官组织细胞均能分泌黏液物质，由于物质中含酸基不同可分为中性黏液物质（中性黏多糖）、酸性黏液物质（酸性黏多糖）和混合性黏液物质（混合性黏多糖）。
表1.2.2-3 PAS反应阳性物质
（1）染色步骤
①蒸馏水洗，高碘酸氧化液5～10min，蒸馏水洗。
②Schiff染液10min（室温过低时可水浴染色），水洗，蒸馏水洗3次，3%醋酸3min。
③阿尔辛蓝液30min，水洗。
④95%乙醇、无水乙醇脱水，透明，封固。
（2）染色原理
阿尔辛蓝（alcian blue）分子中带正电荷的盐键能够与酸性黏液物质中带负电荷的酸性基团结合，再与PAS（periodic acid schiff）进行复合染色即可显示3种不同黏液物质成分。
（3）染色结果
中性黏液物质呈红色；酸性黏液物质呈蓝色；混合性黏液物质呈紫红色。
（四）内源性沉着物染色
1.淀粉样物质染色
淀粉样物质是一种嗜伊红物质，遇碘呈棕褐色，再加稀硫酸变成紫色，因同淀粉反应相似，又称为类淀粉，一般认为属于一种糖蛋白，其蛋白部分与球蛋白相似；淀粉样物质以浸润的形式多见于肝脏、脾脏、肾脏和肾上腺等，也可见于心肌、神经、肠壁、皮肤、肺泡壁、淋巴、甲状腺、舌、喉的间质和血管内，多见于全身消耗性疾病，如慢性化脓性感染、结核、麻风、肿瘤等。淀粉样物质染色方法有碱性刚果红染色法、甲基紫染色法等。
（1）碱性刚果红染色步骤
①苏木素染色2min，水洗，分化，水洗，蒸馏水洗。
②碱性工作液10～20min，不洗，滤纸吸干液体，刚果红工作液10～20min，不洗，滤纸吸干液体。
③无水乙醇迅速脱水2次，透明，封固。
（2）用苏木素染细胞核时不能太深，防止对比不清晰，因为无水乙醇对刚果红有脱色作用，脱水后立即吹干后再透明、封固。
（3）刚果红是一种偶氮类染料，以氨基和淀粉样物质的羟基结合，而附着于淀粉样物质的纤维上，在偏光显微镜下呈有特征的绿色双折光性，光镜下淀粉样物质呈红色，细胞核呈蓝色。
2.纤维素染色
纤维素（fibrin）又称纤维蛋白，是存在于血液内的纤维蛋白原分子聚合形成的特殊蛋白质，病理状态下，组织内出现纤维素证明血管壁通透性增高，使血浆内的纤维蛋白原分子通过，是常见的局部炎症反应或过敏性反应的表现。纤维素常见于炎性渗出、弥漫性血管内凝血（DIC）、高血压的小血管壁和一些胶原性疾病的疏松纤维，肾小球的毛细血管腔内和基底膜等均有纤维素存在。全身结缔组织病时可见纤维素样变性。纤维素可与嗜酸性染料结合，在HE染色中呈嗜伊红性，为细丝状并互相连接成网状，也可互相融合；PAS反应呈阳性；新鲜的纤维素用脂质染色呈弱阳性；PTAH染色呈蓝色；在Lendrum MSB染色中，新鲜纤维素被染成红色，陈旧性纤维素呈紫蓝色，肌纤维呈红色，胶原纤维呈蓝色，细胞核呈蓝色，红细胞呈黄色。
Lendrum MSB染色步骤：
（1）天青石蓝3～5min，水洗，蒸馏水洗。
（2）Mayer或Harris苏木素5min，水洗，分化，水洗，95%酒精5～10s。
（3）马休黄染液2～3min，蒸馏水洗。
（4）酸性品红染液5～10min，蒸馏水洗（或亮结晶猩红6R10min，蒸馏水洗）。
（5）1%磷钨酸5min，蒸馏水洗。
（6）苯胺蓝染液5～10min，蒸馏水洗。
（7）1%醋酸1min，不洗，滤纸吸干水分。
（8）无水乙醇脱水、透明封固。
（五）色素类染色
1.含铁血黄素染色法
（1）含铁血黄素是一种血红蛋白自源性色素，HE染色呈金黄色或棕黄色大小不等、形态不一的颗粒，具有折光性；不溶于碱性溶液和有机溶剂，可溶于酸性溶液；正常情况下在骨髓、肝脏、脾脏等处可见到少量含铁血黄素，大量出现则为病理现象。
（2）含铁血黄素染色原理：含铁血黄素是由氢氧化铁和铁蛋白组成的复合物，由于铁蛋白分子含有高铁盐，可与亚铁氰化钾作用产生亚铁氰化铁，呈现蓝色，称为普鲁士蓝反应。
（3）普鲁士蓝反应法染色步骤
①蒸馏水洗，新鲜配制的Perls液10～20min。
②蒸馏水洗5～10s，0.5%酸性品红1～2min，蒸馏水洗5～10s。
③95%乙醇、无水乙醇脱水，透明，封固。
（4）普鲁士蓝反应法染色结果为含铁血黄素被染成蓝色，细胞核呈红色；实验过程中的器皿要求化学纯净，不要和金属接触，不可用自来水冲洗，避免水管内的铁离子与组织内的钙盐结合出现阳性反应，染色后及时观察，避免放置时间过长至切片脱色，无法观察。
（六）肾脏基底膜染色法
基底膜由Ⅳ型胶原纤维蛋白、蛋白多糖和层黏连蛋白组成，PAS反应阳性、具有嗜银性；Masson 三色染色法可被亮绿染成绿色或被天青石蓝染成蓝色，PAS染色将基底膜染成紫红色，PASM（高碘酸六胺银染色）将其染成黑色。
1.PASM染色步骤
（1）0.5%高碘酸10min，水洗。
（2）5%铬酸30～40min，水洗，1%硫代硫酸钠5s，蒸馏水洗。
（3）六胺银工作液（60℃温箱预热）20min，蒸馏水洗。
（4）0.1%氯化金3min，蒸馏水洗，5%硫代硫酸钠1min。
（5）水洗，HE染色，脱水，透明，封固。
2.染色效果
染色效果如图1.2.2-3所示（见彩插）。
（七）影响特殊染色效果的因素和处理办法
特殊染色主要的影响因素有实验室温度、试剂使用时间、染色时间等。如果实验室室温低于18℃时，最好在水浴40℃条件下染色；试剂使用一段时间后，染色剂的浓度受到影响，故要及时更换染液，一般以染100张/100mL染液为标准；染色时间以镜下控制为准，根据实际染色情况决定，有时因为染色标本的个体因素会影响到染色时间的长短；也可利用组织微波仪增强染色效果并缩短染色时间。