苏木素-伊红染色（HE染色）方法
苏木素（hematoxylin）和伊红（eosin）染色法，简称HE染色，是病理学与组织学中应用最广泛的染色，通常称为常规染色。
（一）HE染色基本原理
1.细胞核染色原理
细胞核的主要化学成分是核酸和蛋白质。HE染色中，细胞核内的染色质主要是DNA，DNA双螺旋结构中的2条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木素碱性染料以离子键或氢键的形式结合而被染色。苏木素在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。
2.细胞质染色原理
细胞质内的主要成分是蛋白质，为两性化合物，其染色结果与pH值相关，当pH值调到蛋白质等电点（4.7～5.0）时，细胞质对外不显电性，酸性染料的碱性染料均不易着色；当pH值调至大于等电点（6.7～6.8）时，表现为酸性电离而带负电荷（阴离子），可被带正电荷的染料染色，同时细胞核也被染色，核、质难以分辨。因此必须把pH值调至细胞质等电点以下，在染液中加入醋酸使细胞质带正电荷（阳离子），就可被带负电荷（阴离子）的染料染色。伊红Y是一种化学合成的酸性染料，在水中解离成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷（阳离子）结合而使细胞质被染色，细胞质、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色和粉红色，从而与蓝色的细胞核形成鲜明对比。
3.二甲苯、乙醇和水洗的作用
（1）二甲苯的作用
因为石蜡妨碍水及各种化学试剂进入组织，所以制作好的石蜡切片在做各种染色前必须用二甲苯将组织表面的石蜡脱干净。只要是石蜡切片无论是做HE染色还是其他特殊染色、免疫组化染色、原位杂交技术染色，均需先将石蜡切片彻底脱蜡，脱蜡不彻底直接导致各种染料、试剂不能进入组织，切片无法着色或着色模糊。染色结束后还需用二甲苯透明，利于光线通过，使切片清晰。
（2）乙醇的作用
在进行苏木素染色前用来处理切片的梯度乙醇的浓度是从高到低，其目的是先利用无水乙醇可与二甲苯混溶的特性，洗净组织内脱蜡的二甲苯；再利用95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇将水逐渐带入组织中，以免引起组织形态结构的人工改变，并为苏木素进入组织打好初步基础。
在伊红染色结束后用的梯度乙醇是从低浓度到高浓度，其目的是逐渐脱去组织中过多的水分，让组织形态恢复并为透明用的二甲苯提供条件。
（3）水洗的作用
脱蜡至80%乙醇后水洗，是为了将水带入组织，从而利于苏木素染液进入细胞核；苏木素染色后水洗是为了洗去未结合的染液，不会把过多的染液带入分化液中，影响分化液使用时间；分化后水洗是为了洗去分化液和脱下的染料，终止分化；返蓝后水洗是为了洗去淡氨水，不要将其带入伊红染液当中，影响伊红染色的效果。
4.分化液和淡氨水的作用
（1）分化液的作用
苏木素染色、水洗后进入盐酸-乙醇液，是为了将细胞核中结合过多的染料和细胞质中吸附的染料脱去，从而保证细胞核和细胞质染色的分明，这一步骤称为分化。由于酸能破坏苏木素的醌型结构，使色素与组织解离，故分化不可过度，以免造成核着色过浅；如果分化过度，可水洗后重染来补救。
（2）淡氨水的作用
分化、水洗后进入弱碱性的淡氨水使苏木素在细胞核内呈蓝色称为返蓝（蓝化作用）。这是因为，苏木素在酸性条件下处于红色离子状态，而在碱性条件下处于蓝色离子状态，呈蓝色。也可用自来水或温水浸洗达到返蓝的目的，但这样处理的细胞核颜色多偏紫，没有淡氨水的效果好。
（二）染色前切片预处理
1.脱福尔马林色素
用福尔马林固定久的组织会产生黑色或棕色的颗粒，HE染色前须脱去色素，否则会影响组织结构观察和病理诊断。
具体步骤如下：
（1）石蜡切片脱蜡至水洗；Verocay液（1%氢氧化钠1mL+80%乙醇99mL）10min；
（2）流水冲洗5min；
（3）常规染色。
2.脱黑色素
组织中黑色素过多，会影响组织结构观察，须在做常规染色前将黑色素脱去再行染色。
具体步骤如下：
（1）石蜡切片脱蜡至水洗；
（2）浸入0.25%高锰酸钾1～3h；
（3）自来水洗1min；
（4）5%草酸洗30min；
（5）自来水洗1min；
（6）常规染色。
（三）染色步骤
1.常规石蜡切片的染色方法
（1）二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ脱蜡5～10min；
（2）无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各2min；
（3）95%乙醇→90%乙醇→80%乙醇→自来水洗各1～2min；
（4）Harris苏木素染色1～5min；
（5）自来水洗1min，盐酸-乙醇液分化数秒，自来水洗1min，淡氨水返蓝30s，自来水洗1min；
（6）伊红染色20s～5min；
（7）85%乙醇→90%乙醇→95%乙醇→无水酒精Ⅰ、Ⅱ各1～2min；
（8）二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ透明各5min；
（9）中性树胶封固。
2.冰冻切片的染色方法
（1）切好的冰冻切片用95%乙醇固定1min或用甲醇-冰醋酸液（97mL甲醇+3mL冰醋酸）固定10～20s；
（2）自来水洗30s；
（3）Harris苏木素染色1～2min；
（4）自来水洗1min，盐酸-乙醇液分化数秒，自来水洗1min，淡氨水返蓝30s，自来水洗1min；(https://www.daowen.com)
（5）伊红20s～5min；
（6）85%乙醇→90%乙醇→95%乙醇→无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各1～2min；
（7）二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ透明各5min；
（8）中性树胶封固。
3.脱落细胞涂片的染色方法
（1）固定好的切片自来水洗1min；
（2）Harris苏木素染色1～5min；
（3）自来水洗1min，盐酸-乙醇液分化数秒，自来水洗1min，淡氨水返蓝30s，自来水洗1min；
（4）伊红染色20s～5min；
（5）85%乙醇→90%乙醇→95%乙醇→无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各1～2min；
（6）二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ透明各5min；
（7）中性树胶封固。
（四）染色液的配制
1.常用的苏木素染液配制
（1）Harris苏木素的配制
①所需试剂和药品为苏木素1g、无水乙醇10mL、硫酸铝钾20g、蒸馏水200mL。
②配制方法为先分别用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾、无水乙醇，加热溶解苏木素，再将溶好的苏木素倒入硫酸铝钾溶液中煮沸1min，稍冷却后慢慢加入红色氧化汞0.5g，此时会产生大量气泡，故容器要大，继续加热至染液变为紫红色，将染液迅速放入冷水中，并用棉花覆盖瓶口，用前用滤纸过滤后每100mL染液加4mL冰醋酸即可使用。
③染色时间为1～5min。
（2）改良Mayer苏木素的配制
①所需试剂和药品为苏木素2g、无水乙醇40mL、硫酸铝钾100g、蒸馏水600mL。
②配制方法为先分别用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾、无水乙醇，加热溶解苏木素，再将溶好的苏木素倒入硫酸铝钾溶液中煮沸2min，用蒸馏水补足600mL，加入0.4g碘酸钠混匀，苏木素呈紫红色，用前用滤纸过滤。
③染色时间为10～20min。
2.伊红溶液配制
（1）水溶性伊红溶液
①所需试剂和药品为伊红Y0.5～1g、蒸馏水100mL。
②配制方法为将水溶性伊红加入蒸馏水中，用玻璃棒混匀后过滤，使用前每100mL加冰醋酸1滴；
③染色时间1～5min。
（2）醇溶性伊红溶液
①所需试剂和药品为醇溶性伊红0.5～1g、95%乙醇100mL。
②配制方法为将伊红溶于95%乙醇中，用玻璃棒混匀后过滤，使用前每100mL加冰醋酸1滴。
③染色时间为5～10s，伊红溶液染色前切片需在95%乙醇内浸泡10s。
④醇溶性伊红即沉淀酸化伊红，市场有售，实验室内也可将水溶性伊红经处理后使之成为醇溶性伊红。
（3）实验室醇溶性伊红配制方法如下
①将水溶性伊红Y20g与500mL蒸馏水混合溶解后加入浓盐酸10mL，搅拌、过夜。
②第二天过滤，滤液不要，用蒸馏水多次冲洗滤纸中的沉淀，然后将沉淀物连同滤纸一起入60℃温箱中干燥，用95%乙醇1000mL配成饱和液。
③使用前取饱和液1份、95%乙醇2～3份，配成染色液。
3.分化液和返蓝液的配制
（1）分化液
将浓盐酸0.5mL加入75%乙醇99.5mL中即可，此液使用一段时间后需要延长时间或更换液体。
（2）返蓝液
将1mL氨水加入99mL蒸馏水中即可。
（五）HE染色注意事项
1.从脱蜡开始到透明所用试剂要定期更换，一般为以每缸试剂500mL为准，每处理500张切片更换一次。
2.新配置的染液染色效果好，时间可以短一些，使用一段时间后的染液时间要适当延长。苏木素染液呈现暗红色，遇水即变蓝色时说明染液已经失效，已不能使用。
3.实验室的室温决定了制作切片的每一步的时间和效果，当室温低于18℃时时间要延长，除分化液外的每缸试剂处理时间要延长1～3min，其中苏木素和伊红的染色时间以染出满意效果为准。
4.脱水过程中用的低浓度乙醇对伊红有分化作用，故在脱水过程中过低浓度乙醇时动作要略快，脱水不彻底会造成切片发雾。
（六）HE染色的结果
细胞核被苏木素染成蓝色；软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色；黏液呈灰蓝色。细胞质被伊红染成深浅不同的粉红色或桃红色，细胞质内嗜酸性颗粒呈鲜红色；胶原纤维呈淡粉红色，弹性纤维呈亮粉红色；红细胞呈橘红色。
质量好的HE切片，细胞核与细胞质蓝红相映、色彩鲜艳，细胞核鲜明、核膜及染色质颗粒均清晰可见。组织细胞的一般形态结构特点及很多物质成分均能显示出来。优质的HE切片可以长期保存，不褪色。
染色效果如图1.2.2-1所示（见彩插）。