免疫组织化学和免疫荧光细胞化学染色法
（一）免疫组织化学法（immunohistochemistry）
利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素等）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学法。
（二）免疫组织化学试剂的保存
抗体保存得当与否直接决定了抗体的活性和使用效果。保存得当的抗体活性可以维持数月甚至数年，一般按照说明书或者抗体标签上推荐的保存条件即可，一般即用型抗体在4℃冰箱内保存，浓缩型抗体有的在4℃冰箱内保存，大多都需在-20℃条件下保存（有液态和冻干粉2种）。须注意需要在-20℃条件保存的液态抗体应避免反复冻融。收到抗体后先以1000～3000r/min的转速离心1～2min后再打开管盖进行分装和保存，这是因为在运输过程中反复颠簸，管内微量抗体容易聚集在管盖处，一旦直接打开容易流失抗体，转速不宜过快，时间不宜过长，否则会导致蛋白沉淀，影响液体浓度。
分装可以最大限度地降低反复冻融对抗体活性的损害，同时也降低了多次从同一管中吸取抗体造成污染的可能性。分装的量以10μL/份为佳，分装体积过小抗体浓度可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响，分装次数越多移液吸头吸附的抗体也越多，最好用无菌的经过硅化处理的0.2mL离心管来分装抗体，未经硅化处理的分装管容易吸附抗体蛋白，影响抗体活性。分装时将无菌的微量移液器吸头先插入管底部反复吹打几次后再吸出抗体，使抗体有效成分与抗体保护剂充分混匀，如抗体为100μL包装时，可一次性分为10份，每次取用1份。分装好的抗体要用封口膜将管口密封，减少溶剂蒸发。
FITC和CY3和TRITC标记的抗体（二抗）对光极为敏感，此类抗体一般是在棕色管中保存或使用。
（三）免疫组织化学染色前准备和染色后处理
1.中性固定液可以较好地保存组织的抗原性，酸性固定液可造成蛋白质三元和四元结构破坏从而使组织丧失一定的抗原性。用酸性脱钙液处理的标本脱钙时间较长会影响组织抗原性。细胞涂片、爬片可直接用中性甲醛固定后染色。
2.免疫组织化学切片在制作过程中容易发生脱片，故载玻片需经防脱处理，先将载玻片在清洗液内浸泡至少24h后彻底水洗、蒸馏水洗、乙醇浸泡，烘干后防脱处理。常用的防脱剂有多聚赖氨酸（Poly-L-Lysin）或3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷（APES）等，多聚赖氨酸的防脱效果优于APES，明胶处理的载玻片在套核时容易被苏木素染成蓝色，而多聚赖氨酸或APES处理的载玻片不会发生此情况，现在有阳离子处理的防脱片，效果也较好但价位较高，所以一般以多聚赖氨酸处理的载玻片为首选。
3.石蜡对组织抗原有影响，所以石蜡切片在做组织化学前须经抗原修复，一般是脱蜡水洗后需用蒸馏水洗3min×3，PBS洗3min×3，并按所选一抗要求进行抗原修复；而冰冻切片、细胞涂片、爬片不会影响细胞、组织的抗原性，经固定蒸馏水洗、PBS洗后可不需修复，直接染色。
4.抗原修复法
（1）酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶）37℃温箱修复15min。
（2）枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液（pH6.0）修复：①高压热修复3min（组织直接浸入足量修复液，从压阀吱气开始计时），自来水冲洗锅盖降至室温；②微波热修复（高火）10～20min，自然复温。
（3）EDTA（pH8.0～9.5）修复：①高压热修复3min（组织直接浸入足量修复液，从压阀吱气开始计时），自来水冲洗锅盖降至室温；②微波热修复10～20min，自然复温。
5.增加细胞膜通透性
Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚，C34H62O11）是一种非离子型表面活性剂（或称去污剂），相对分子质量为646.86。免疫细胞化学中利用其能溶解脂质的特性，以增加抗体对细胞膜的通透性，方法为加过氧化氢前用0.1%Triton X-100室温或37℃温箱5～10min。
6.免疫组织化学染色后，为了在镜下能更好地观察细胞、组织结构，一般需用苏木素复染套核；染色过程中细胞内水含量过多影响细胞正常形态，故需要脱水透明（参考HE染色），需注意实验室中不同的染色方法（包括常规染色、特殊染色、免疫组织化学染色等）不可以混用脱水用乙醇，因为许多染色剂都可以溶于乙醇，特别是醇溶性伊红会对免疫组织化学染色的细胞质造成影响。
（四）常用的免疫组织化学染色试剂盒简介及操作步骤
1.ABC（卵白素-生物素-过氧化物酶连接法）系列检测试剂盒
ABC系列检测试剂盒是利用卵白素与生物素特有的高亲和力，先将生物素与辣根过氧化物酶（HRP）结合，形成生物素化辣根过氧化物酶，然后与卵白素按一定比例混合，形成ABC复合物。用生物素化二抗与一抗结合，再与ABC复合物联结形成抗原-抗体-生物素化二抗-ABC，最后用底物显色。其内容有A液（封闭用血清）、B液（生物素标记二抗）、C液（卵白素）和D液（生物素化辣根过氧化物酶）。ABC系列检测试剂盒操作步骤参见产品说明书。
2.SP（链霉卵白素-过氧化物酶连接法）系列检测试剂盒
SP系列检测试剂盒用链霉菌抗生素蛋白代替ABC复合物中的卵白素，原理同ABC法，其敏感性较ABC法高。国外一些公司将其注册为LSAB法、LAB-SA法和SABC法等。此试剂盒适用于大多数组织但对于内源性生物素含量比较丰富的组织（如肝脏、肾脏等）应选用非生物素检测系统或加用抗生素（avidin）封闭。其内容有A液（封闭用正常山羊血清）、B液（生物素标记二抗）和C液（辣根酶标记链霉卵白素）。操作步骤参见产品说明书。
3.增强型一步法Polymer检测试剂盒
它将二抗抗体分子的单价Fab片段和酶聚合在一起，替代传统方法中的二抗和三抗，直接放大抗原抗体结合的信号，既保留了抗体特异性结合抗原的能力，又可有效地避免聚合分子过大而造成的空间位阻。与SP试剂盒相比更为简单且敏感，且因为不使用生物素，从而避免了由于内源性生物素所造成的背景染色。操作步骤参见产品说明书。
4.超敏型检测试剂盒
其原理同增强型检测试剂盒，且由于其特有的增强剂可以使细胞的通透性发生改变，有利于大分子的检测系统更好地结合所检测的一抗分子，故其灵敏度更优。其内容为试剂1（增强剂）、试剂2（HRP标记聚合物）。操作步骤参见产品说明书。
5.TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling）细胞凋亡检测试剂盒
TUNEL细胞凋亡检测试剂盒是采用非同位素方法来检测细胞在凋亡过程中DNA的断裂情况，可在原位快速、准确地检测单个凋亡细胞。该试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）的凋亡原位检测。其原理是细胞凋亡发生时，内源性核酸酶激活，使DNA的双链断裂或一条链出现缺口，产生一系列3′-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）作用下，组织细胞原位DNA切口可被标记上生物素-dUTP，即TUNEL（应用DNA聚合酶和末端脱氧核糖核酸转移酶标记DNA链断端的核酸），可与连接了辣根过氧化物酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）特异结合，在辣根过氧化物酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，显示为棕色（过氧化物酶活性）或在荧光二抗的存在下在荧光显微镜或在共聚焦显微镜下被激发，特异、准确地定位正在凋亡的细胞，在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞。或在荧光二抗的存在下在荧光显微镜或在共聚焦显微镜下被激发而定位正在凋亡的细胞。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3′-OH形成，几乎不被表达。TUNEL细胞凋亡检测试剂盒的组成及操作步骤参见产品说明书。
（五）免疫组织化学染色常见问题的处理
1.无/弱着色
（1）组织固定
①新鲜组织固定不够会造成蛋白弥散或降解，出现阴性染色或周边阳性中心阴性染色。
②组织过度固定会造成蛋白空间结构交联过度，即使经过抗原热修复也难以出现阳性结果，或出现中心阳性周围阴性的结果。
③最好选用中性福尔马林固定6～24h。
④由于Vimentin蛋白抗原决定簇对醛类比较敏感且又广泛存在于各种组织中，故可将其作为标本固定情况的指标，参考其染色结果判断组织固定情况。
（2）烤片
烤片条件为58～60℃温箱1～2h或过夜（不宜超过18h），烤片温度过高、时间过长都会破坏抗原决定簇，产生假阴性。
（3）一抗
抗体储存不当、反复冻融、浓度过低、抗体过期、一抗孵育时间过短、抗体选择错误都会造成假阴性。严格按照说明书储存一抗，合理分装一抗、提高一抗浓度、延长孵育时间等措施可以改善染色，一抗如是抗人组织抗体则多不能在大鼠、小鼠的组织上表达，反之亦然。
（4）检测系统
所选用的检测系统应与一抗匹配，通用型检测系统只能用于来源于小鼠和兔的一抗而不能用于来源于山羊的一抗；检测系统孵育时间不宜过短或过长，要严格控制孵育时间。如果不能得到好的检测结果可尝试选用超敏试剂盒来染色。
（5）显色系统
所用的显色剂应是检测系统中标记酶的底物，一般辣根酶用DAB（棕色）和AEC（红色）显色，碱性磷酸酶用BCIP/NBT（蓝色）和AP-red（红色）显色，其中DAB的灵敏度最高是AEC的四倍。(https://www.daowen.com)
（6）封片
底物所产生的终末产物（如AEC和AP-red）溶于有机溶剂时不宜选用醇溶性封片剂，否则会产生褪色。醇溶性封片剂有中性树胶、香味封片剂；水溶性封片剂为GVA。
（7）修复
修复持续时间过短、温度过低、修复方法选择不正确导致无/弱着色。如CD15需选用胃蛋白消化酶修复，如选用枸橼酸盐缓冲液修复会减弱阳性表达；CD56需要用EDTA8.0修复，如用枸橼酸盐修复亦不会表达。
（8）其他因素
①切片上残留的PBS/TBS过多，进一步稀释了抗体：可通过设立对照片来检测；
②复染过深遮盖阳性信号，特别是核阳性的抗体；
③某些抗原决定簇对H2O2敏感，如CD4单克隆抗体：需应用低浓度的H2O2或省略；
④实验中所选蜡块保存时间过长（超过1年）时，容易出现假阴性：可通过延长修复时间使抗原尽可能暴露，最好选用近期制作的蜡块；
⑤室温过低：保证室温不低于18℃。
2.非特异性染色
（1）内源性生物素
人体中生物素与线粒体丙酮酸盐羧化酶相关，富含线粒体的细胞具有丰富的内源性生物素，如肝脏、肾脏及一些肿瘤细胞。如果使用生物素/卵白素检测系统，由于卵白素可以和生物素不可逆地强结合，会导致非特异性染色，热介导的抗原修复可以复活内源性生物素，所以更加剧非特异性染色。可以通过选用非生物素的检测系统，还可以用以下方法封闭内源性生物素：首先用蛋清中（一个蛋清加入100mL的PBS中）的卵白素封闭，再用5%脱脂奶粉作为生物素替代品封闭卵白素中未结合的位点，冲洗后即可加一抗。
（2）内源性过氧化物酶
一般红细胞和中性粒细胞中的过氧化物酶含量比较高，会造成非特异性染色。0.3%～3%H2O2，用PBS（pH7.4）或蒸馏水或甲醇配制。
（3）冲洗步骤
免疫组织化学染色步骤中包括多次冲洗过程，任何一步出现冲洗不干净的问题，都可能产生背景染色。在冲洗中加入吐温20即可，一般1000mL冲洗液中加0.2mL的吐温20。
（4）鼠单抗用于鼠组织
由于小鼠组织中可能含有内源性IgG，会造成非特异性染色，可选用Mouse-to-Mouse检测试剂盒来解决。
（5）固定不及时
固定不及时可造成蛋白弥散，会造成异位染色。
（6）干片
孵育过程中没有放入湿盒或加入液体过少或孵育时间过长，都会造成干片引起非特异性染色。
（7）修复过度
抗原热修复（尤为EDTA）有时会造成细胞核异位染色，可通过对照片加以甄别。
3.染色过深
造成染色过深的原因有一抗浓度过高、检测试剂浓度过高或孵育时间过长、显色剂浓度过高或孵育时间过长。
（六）免疫荧光细胞化学（直接法）
用已知特异性抗体与荧光素结合，制成特异性荧光抗体，直接用于细胞或组织抗原的检查，此法特异性高，常用于肾穿刺和病原体检查，其缺点是一种荧光抗体只能检查一种抗原，操作时注意避光，步骤如下：
1.组织制作冰冻切片（或细胞涂片、细胞爬片等），室温干燥30min，4℃丙酮固定10min；
2.PBS洗3min×3；
3.滴加稀释好的荧光素标记抗体37℃孵育30min；
4.PBS洗3min×3，荧光镜检（或风干后缓冲甘油封片，荧光镜检）。
染色效果如图1.2.2-4所示（见彩插）。
（七）免疫荧光细胞化学（间接法）
用特异性抗体（一抗）与组织结合，再用间接荧光抗体（荧光二抗）与结合在抗原上的抗体（荧光二抗的抗原）结合，形成抗原-抗体-荧光抗体复合物，操作时注意避光，步骤如下：
1.组织制作冰冻切片、细胞涂片、细胞爬片等室温干燥30min，4℃丙酮固定10min（石蜡切片脱蜡至抗原修复）；
2.PBS洗3min×3；
3.滴加一抗4℃冰箱过夜或37℃孵育1～2h；
4.PBS洗3min×3；
5.滴加稀释好的荧光二抗37℃孵育30min；
6.PBS洗3min×3，荧光镜检（或风干后缓冲甘油封片，荧光镜检）。
（谷 弘）