三、药物敏感试验
临床上细菌性感染的病原菌种类与耐药性已发生很大变化，体外药敏试验是帮助选择敏感药物的重要手段。因此，对药敏试验的原理和方法、影响因素、敏感度判定标准和临床意义应有较全面的了解。
（一）药敏试验的原理与方法
测定抗菌药物在体外对病原菌有无抑制作用的方法，称为抗菌药物敏感试验，简称药敏试验。评定药敏结果的方法有两种，以抑制细菌生长为标准，常用最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）表示；以杀灭细菌为标准（活菌减少99.9%以上），则用最低杀菌浓度（minimal bactericidal concentration，MBC）表示。一般说来，抗菌药物在体内的有效治疗浓度应是MIC的2～4倍。根据临床用药后药物在体内的浓度与所测MIC的比值，又可将药敏结果判定分为敏感、中敏和耐药三种。分析一批菌株时，将可抑制50%受试菌株生长的最低抑菌浓度称为MIC50，可抑制90%受试菌株生长的最低抑菌浓度称为MIC90。药物敏感试验有多种方法，细菌对各种抗生素的敏感性各不相同，即使同种细菌的不同菌株对同种抗生素的敏感性也有差异。因此，药物敏感试验是临床正确合理使用抗生素的可靠依据。常用的药敏试验方法有以下几种。
1.稀释法。即最低（或最小）抑菌浓度（MIC）的测定。最大优点是其能直接测定MIC，对指导临床精确选择抗生素种类和设计最佳给药方案具有重要价值。同时有多个敏感药物可供选择时，从临床微生物学的角度，应选择MIC值明显低于敏感度判定值的药物。
（1）试管稀释法：在含有肉汤或琼脂培养基和经不同倍数（通常为双倍）稀释的一排试管内，分别加入等量的细菌，培养后观察细菌生长情况。无细菌生长的含抗菌药物试管中所对应的最低药物浓度管为该抗菌药物对受试细菌的MIC。将肉眼观察无菌生长的各试管培养液分别移种至不含抗菌药物的培养皿，过夜培养后菌落数不超过5个所对应的最低药物浓度管为该抗菌药物对受试细菌的MBC。试管稀释法是经典的药敏试验方法，但材料消耗大、操作烦琐，且结果重复性差，临床实验室已不作为常规药敏试验方法。
（2）琼脂稀释法：上述实验如采用琼脂平皿代替试管作为载体，以无菌落生长的平皿中所对应含抗菌药物最低药物浓度判为MIC的方法，称为琼脂稀释法。本法比试管稀释法的重复性好，如配合多点接种器，可同时进行大量的菌株检测。但是琼脂稀释法不能测定MBC，实验操作烦琐，少量菌株测定时材料浪费大，故此法在临床实验室难以常规应用。
（3）微量稀释法：用预先配制好培养基和按一定倍数稀释的抗菌药物的微量孔板（药敏板或药敏卡）进行药敏试验，称为微量稀释法。培养后观察各孔浊度变化便可确定十余种抗菌药物对细菌的MIC。微量稀释法药敏试验材料消耗甚少，结果快速、准确、直观，能测MIC，且操作简单，易于标准化和自动化，是今后药敏试验发展的一大趋势。微量稀释法不能区分接种液中的污染菌，接种过程必须严格遵循无菌操作，受试菌应为纯菌株，否则可影响MIC结果。
2.琼脂扩散法（纸片法）。将浸有抗菌药物的纸片贴在涂有细菌的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，其浓度呈梯度递减，在纸片周围一定距离内的细菌生长受到抑制，过夜培养后形成一个抑菌圈，其直径大小与药物浓度的对数呈线性关系，与MIC的对数则成反比关系。用稀释法和扩散法同时测试一定数量的菌株，可得到代表这种关系的回归线。用扩散法测试的菌株，根据这一回归线，可由抑菌圈直径大致推测抗菌药物对该菌的MIC，并由此推断出细菌对抗菌药物的敏感程度即敏感、中敏和耐药。
琼脂扩散法操作简单，材料消耗少，是目前我国临床细菌室常用的药敏测试方法。但琼脂扩散法影响因素较多，为此WHO和NCCLS（美国国家临床实验室标准委员会）进行了规定，使药敏结果的正确性和重现性极大提高。琼脂扩散法主要适用于生长较快的需氧菌和兼性厌氧菌。一些不能在MH培养基上生长或生长不良的细菌，如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和淋病奈瑟菌等，培养基内必须补充特殊的营养成分。
3.Etest法（E实验）。本法是一种新型的药敏试验方法，结合扩散法和稀释法的原理和特点。操作方法类似于纸片扩散法，纸片条含一种连续不间断浓度梯度的抗菌药物。35℃培养18～20h后观察结果。Etest能测MIC，结果直观、准确，且操作简单，无须特殊仪器设备。接种菌液中即使混有少量其他污染菌，MIC结果判读时也常可予以区分。本法由于结果准确、稳定，受到认同。
4.联合药敏实验法。主要方法很多，如平板纸条交错法，低度纸条实验法，试管方阵交叉联合法、纸片法、实验法及试管简易交叉联合法等。其中纸片法较为简便，最为常用。下面主要介绍纸片法的实验方法。先将试验细菌液均匀涂布于培养基表面，盖好平皿，放置5min，将平板表面水分吸收后，将两种含药纸片贴于平板上，两纸片中心点距离24mm左右，然后置于37℃孵育过夜，取出观察结果。根据呈现的抑菌图形报告“协同” “累加” “无关”或“拮抗”作用。(https://www.daowen.com)
（二）药敏试验的影响因素
影响药敏试验结果的因素很多，例如纸片扩散法就有培养基种类、pH和琼脂厚度、接种细菌浓度、结果观察时间等，如没有严格按照NCCLS所规定的纸片扩散法的操作步骤和方法，药敏结果就会有较大差异。为使药敏试验的结果准确可靠、重复性好、具有可比性，并能迅速反映出细菌耐药特性的变迁，应采用标准化的药敏试验方法，尽量消除一切可能影响药敏结果判读的因素。
另外，部分抗菌药物受热后效价下降是药敏试验质控所不容忽视的另一重要问题。有些则因试剂生产工艺不佳，如采用饱和（浸泡）法制作药敏纸片，每一纸片药物含量相差悬殊而导致假敏感或假耐药。
为保证药敏试验结果的准确性，临床细菌室应每周用标准敏感菌株对实验室进行质量控制，定期药敏质控是避免错误药敏结果的有效方法。对质量控制菌株所测的抑菌圈直径或MIC连续多次超出NCCLS所规定的质控范围，提示药敏试验的准确性存在问题，应查找原因如培养基和药敏纸片的质量等，并积极予以纠正。
（三）药敏试验的临床意义
1.药敏试验的作用与指征。进行药敏试验有两个目的：其一是帮助临床医师选择最合适的抗菌药物，提高细菌性感染的治愈率；其二是进行细菌耐药性监测和研究，了解本医院、本地区或更大范围内细菌耐药性变迁，以便采取措施，防止或减缓耐药性的发展。
对污染菌，如普通咳痰培养所分离的草绿色链球菌、口腔奈瑟菌群等上呼吸道正常菌群、血培养分离的枯草杆菌等皮肤或环境污染菌，不应做药敏试验。除流行病学监测和研究目的外，已知对某些抗菌药物具有良好敏感性而很少出现耐药的细菌如化脓性链球菌以及对一些营养要求高、普通培养基上不易生长的细菌如淋球菌和流感嗜血杆菌等，一般也不必常规进行药敏试验。
厌氧菌药敏方法NCCLS推荐采用稀释法，通常厌氧菌不需要进行常规药敏试验，因为多数厌氧菌对常用抗厌氧菌药物敏感。近年来真菌感染率在上升，部分地区的耐药率也有明显增加，临床需要正确的药敏资料指导选药，但是由于真菌生长较慢，某些药物水溶性差且溶解度差异较大，对酸和热不稳定，取得准确的体外药敏结果存在一定困难。最近NCCLS提出酵母样真菌的体外药敏试验操作方法和敏感度判定的推荐标准。
2.药敏结果判定标准与临床意义。药敏结果判定采用三级划分制：①敏感。细菌感染用常规剂量抗菌药物治疗有效时，称细菌对该抗菌药物高度敏感，即常规剂量用药时达到的平均血浓度超过该细菌MIC的5倍以上。②中敏或中介。当细菌感染仅在用大剂量抗菌药物治疗才有效或细菌处于体内抗菌药物浓缩的体液如尿液、胆汁中才被抑制时，称这种细菌对该抗菌药物中敏，即常规剂量用药时达到的平均血液浓度相当于或略高于该菌的MIC。③耐药。细菌感染在用大剂量抗菌药物治疗无效时，称这种细菌对该抗菌药物耐药，即大剂量用药时的平均血液浓度达不到药物对细菌的MIC。
对于药敏试验的结果，临床医师应学会分析判断，例如：耐甲氧西林或苯唑西林的葡萄球菌（MRSA）意味着其对所有的青霉素、头孢菌素等β-内酰胺类抗生素耐药；ESBL菌株意味着对所有青霉素和头孢菌素类耐药，即使药敏试验显示细菌对个别头孢菌素敏感，临床也不应该使用，因为往往出现治疗失败。耐高浓度庆大霉素的肠球菌则应认为对阿米卡星、妥布霉素等氨基糖苷类耐药。同时应结合患者的具体情况选择适当的抗生素。