1.2　方法

1.2　方法

1.2.1 基因敲除片段的构建及转化

图1　基因敲除示意图
Figure 1　Schematic diagram of gene-knockout strategy

本研究的基因敲除策略采用的是基于融合PCR的split-marker同源敲除策略(Liang et al.2014)，以自带启动子的潮霉素B磷酸转移酶HPT编码基因作为抗性筛选基因，同源重组替换目的基因。如图1所示，A：第一轮PCR，根据目的基因的5＇-侧翼、3＇-侧翼设计引物，引物需加上19bp HPT基因的接头，以野生型菌株基因组DNA为模板，扩增片段①④；同时根据潮霉素基因设计引物，引物需加上目的基因5＇-侧翼、3＇-侧翼19bp序列作为接头，以p KOV21质粒为模板，扩增抗潮霉素基因的前2/3片段②，以及抗潮霉素基因的后2/3片段⑤；B：第二轮PCR，在片段①上设计一条正向引物，片段②上设计一条反向引物，以片段①②为模板，将片段①②经PCR融合为片段③；同理将片段④⑤融合为片段⑥；C.最后将片段③⑥共同转入原生质体中，带有抗潮霉素基因前(后)2/3片段及目的基因上(下)游臂的③⑥片段将通过同源重组形成完整的抗性基因，再通过目的基因上下游臂的同源重组将目的基因替换，从而将目的基因进行敲除。

根据同源敲除原理设计基因敲除引物，每个基因6对基因敲除引物，引物序列请见表1，本研究所有引物均由北京擎科新业生物技术有限公司进行合成。通过PCR扩增基因敲除片段并进行切胶回收，对凝胶电泳检测片段大小正确的片段采用TaKaRa的MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit进行胶回收，按照说明书进行操作。

表1　基因敲除及检测引物序列
Table 1　Primer sequences used for gene knockout，complementation and mutant confirmation

注：CgXX-(1-6)代表基因敲除1～6片段引物；CgXX-T代表目的基因检测引物序列；CgXX-HB，代表回补序列。CTGCAG为酶切位点PstⅠ，AAGCTT为酶切位点HindⅢ
Note：Primer named CgXX-(1～6)represents gene knockout primers of 1～6 segment，CgXX-T for the primers used for detect target genes and CgXX-HB for the primers used for gene rescue.CTGCAG is the restriction enzyme cutting site PstⅠ，AAGCTT is the restriction enzyme cutting site HindⅢ.

1.2.2 原生质体的制备

接种菌块于PDB培养基中，28℃，培养3～7d，经4层无菌擦镜纸过滤，取滤液，8000r/min离心取孢子，接种于PDB液体培养基中。28℃、150r/min，摇床培养12～16h，用4层无菌擦镜纸过滤幼嫩菌丝，并用0.7mol/L NaCl溶液反复冲洗菌丝，使孢子和PDB尽量被冲洗干净，转至无菌的50mL离心管(提前称重)中。称量菌丝重量，按1g菌丝用1mL崩溃酶、1mL溶壁酶、0.5mL蜗牛酶于33℃、130r/min酶解3～4h，显微镜观察原生质体的酶解情况。(以下步骤冰上操作)用4层无菌擦镜纸过滤至50mL无菌离心管中收集原生质体，用0.7mol/L NaCl溶液反复冲洗菌团，收集滤液。4℃、4000r/min，离心15min，弃上清。沉淀用1mL STC(145.75g山梨醇，50mL 1mol/L CaCl2溶液，10mL 1mol/L Tris-HCl溶液，蒸馏水定容至1L)溶液于4℃、4000r/min，离心15min，弃上清，得到的沉淀即为原生质体。用STC溶液将原生质体浓度调至约100个/mL，稀释镜检，血球计数板计数。原生质体100μL/管分装至1.5mL无菌离心管中备用。

1.2.3 原生质体的转化

移液枪吸取融合DNA片段3和片段6各2.5μg于1.5mL无菌离心管中，用TEC(0.5mL 1mol/L Tris-HCl，0.1mL 0.5mol/L EDTA，2mL 1mol/L CaCl2溶液，蒸馏水定容至50mL)溶液将体积补至60μL，冰上放置20min后，12000r/min，离心2min。吸取上清至原生质体中，移液枪吸打混匀(勿剧烈震荡)，冰上放置20r/min。缓慢逐滴加入160μL聚乙二醇PEG［120g PEG4000、25.116g MOPS(3-N-吗啡啉基丙磺酸)，蒸馏水定容至200mL］，充分混匀，室温放置15min。加入1mL STC，混匀，4000r/min，离心5min，去除PEG。沉淀用200μL STC重悬。将50μL转化后的原生质体与6～8mL MM培养基(约37℃、温度过高会影响原生质体活性)于10mL的离心管中颠倒混合，均匀倾倒于37℃预热的MM平板上。待其凝固后，置于28℃培养箱中倒置培养。培养12～20h后，在转化平板上再铺20mL含有浓度100μg/mL潮霉素的TTOP培养基(必须全部铺满)。待其凝固后，置于28℃培养箱中倒置培养直至转化子长出(4～5d)。将转化子用无菌牙签把菌丝挑至含100μg/mL潮霉素的PDA平板上进行培养，进行进一步筛选。(https://www.daowen.com)

1.2.4 转化子的PCR验证

转化子采用常规CTAB法提取菌丝基因组DNA，以提取的转化子DNA为模板，采用3对引物对转化子进行PCR验证：第一对引物设计在目的基因内部(表1，CgXXT)，用来确定目的基因是否被敲除；第二对引物扩增目的基因的5＇-侧翼序列与潮霉素基因融合后的片段，正向引物设计在目的基因的5＇-侧翼序列、片段3的上游(表1，CgXX-1F)，反向引物设计在潮霉素基因内部、片段3的下游(表1，CgXX-2R)，确保同源重组的位置是正确的；第三对引物扩增目的基因的3＇-侧翼序列与潮霉素基因融合后的片段，正向引物设计在潮霉素基因内部、片段6的上游(表1，CgXX-5F)，反向引物设计在目的基因的5＇-侧翼序列、片段6的下游(表1，CgXX-4R)，确保同源重组的位置正确。

1.2.5 基因回补株构建

设计包含了目的基因(包括启动子及终止子)和载体HPT同源臂引物，并添加酶切位点PstⅠ及HindⅢ，引物序列见表1。采用同源重组的策略将目的片段到载体p KOV21。具体步骤如下：以野生型菌株基因组DNA为模板通过PCR扩增目的片段并切胶回收，对载体p KOV21采用限制性内切酶PstⅠ及HindⅢ限制性内切酶酶切(操作参照说明书)。使用Varyme重组试剂盒对含有目的片段和酶切载体进行重组反应(操作参照说明书)。反应产物冰置5min再转入大肠感受态细胞(操作参照说明书)，将转化后均匀涂布于含100μg/mL G418的LB固体平板，37℃倒置培养12～16h，在菌落生长良好且未互相重叠时，挑选阳性单菌落于2mL含1.5mL LB液体培养基的LB离心管并编号，37℃、160r/min培养2～4h。采用目的基因引物(表1，CgXX-T)PCR检测菌液是否含有目的片段，对检测出目的片段的样品送至擎科生物技术有限公司测序。测序结果与基因组序比对检测基因正确性与完整性，移液枪吸取100μL菌液于含有100mL LB培养基的锥形瓶中，37℃、160r/min培养12h。提取质粒即为基因回补载体(操作照说明书)。以对应基因敲除突变体参照1.2.2及1.2.3制备原生质体并将回补载体转化入对应基因敲除突变体菌株。以100μg/mL G418作为抗性筛选转化子，筛选得到的转化子采用目的片段引物(表1，CgXX-T)进行PCR验证。经PCR验证含有目的片段转化子提取DNA进行测序，检验基因正确性与完整性。

1.2.6 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测回补株表达量

采用EasyPure Plant RNA Kit试剂盒(具体操作步骤参照说明书)提取菌丝RNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，并测定RNA的含量和纯度，符合要求的RNA用于反转cDNA。提取的RNA反转录成cDNA使用反转试剂盒Prime-Scrip RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa公司)(具体操作步骤参照说明书)。运用Beacon Designer 7.0软件对相关基因进行RT-qPCR引物设计，引物见表2，RTqPCR反应体参考说明书。

表2　RT-qPCR引物序列
Table 2　RT-qPCR primer sequence

注：Cg01-beta-tubulin为内参基因
Note：Cg01-beta-tubulin is the reference gene.

1.2.7 摇瓶发酵培养及Hup A检测

将保存的菌种活化做成种子液，取1mL种子液接入100mL PDB加富培养基中，28℃、160r/mim，避光培养10d后采用真空泵分离菌液和菌丝。菌丝于60℃烘干至恒重，冷却后称重，重复3次取平均值即为生物量。菌液用旋转蒸发仪浓缩至体积30mL，等体积30mL氯仿萃取一次，再用15mL氯仿再次萃取一次，合并滤液，挥干后加入色谱甲醇溶解，超声10min，混匀后过膜。Agilent Eclipse plus-C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相0.015mol/L乙酸铵　-甲醇溶液(70∶30)，流速1mL/min，柱温35℃，进样量10μL。波长308nm。