2.1　CgClr4、CgClr3、CgSir2基因的敲除

以CgClr4-T(表1)为引物，对经抗性筛选获得8个转化子进行PCR验证。此引物设计在CgClr4基因内部，扩增产物大小为449bp。若转化子中CgClr4基因被潮霉素基因成功替换，则扩增不出目的基因条带。随后以CgClr4-1F/2R(表1)为引物检测转化子上游(3 466bp)，CgClr4-5F/4R(表1)为引物检测转化子下游(2 940bp)。若潮霉素基因同源重组位置正确，则可以扩增出大小正确条带。PCR结果显示均未扩增出目的片段(图2A)，编号1、2、3、5、6、7目的基因侧翼序列与潮霉素基因融合后的片段上下游扩增成功且片段大小正确(图2B；图2C)。在野生型菌株中可以扩增出目的基因条带，而上下游不能扩增出条带(图2D)。证明转化子1、2、3、5、6、7的Cg-Clr4基因敲除成功。转化子筛选过程中出现的如8号片段大小不一致情况，是由于发生了错误的同源重组导致，与CgClr4相似性较高的基因发生了重组。与CgClr4基因敲除同理，对CgClr3和CgSir2基因敲除进行转化子筛选。PCR结果证明7个转化子的CgClr3基因敲除成功(图3A～图3D)。同样对CgSir2转化子筛选也证明基因敲除成功(图4A～图4D)。(https://www.daowen.com)