3　讨论

真菌次级代谢产物的生物合成过程受到众多因素的调控。研究发现，微生物的许多基因在实验室培养条件下处于沉默状态(Scherlach& Hertweck 2009)，沉默的次级代谢生物合成基因簇的激活是目前真菌次级代谢产物研究的热点与难点之一。表观调控可以通过多种酶所共价修饰，引起染色质的结构的变化从而激活沉默基因的表达(Shilatifard 2006)，是研究真菌次级代谢产物的有效途径之一。在本研究对胶胞炭疽Cg01中3个表观修饰相关基因CgClr4、CgClr3和CgSir2进行了基因功能验证，以研究其与次生代谢产物Hup A合成的关系。

CgClr4是组蛋白甲基化酶(histonemethyl transferase，HMT)基因。Clr4可作用于组蛋白赖氨酸H3K9位点的甲基化，可特异性招募异染色蛋白heterochromatin protein 1(HP1)到染色质，HP1与多种转录抑制因子结合从而导致基因的沉默(Hiragami et al.2005)。如构巢曲霉中敲除编码H3K4基因Ccl A后H3K4甲基化水平显著降低，并伴随着H3K9的甲基化水平下降，结果激活了至少2条沉默基因簇的表达以及8种新化合物的产生(Bok et al.2009)。但也有报道认为，在发生于基因启动子区域的H3K9甲基化与转录抑制相关，而发生在基因编码区H3K9甲基化与转录激活制相关(Vakoc et al.2005)。本研究中Clr4基因敲除后可能降低了基因编码区H3K9甲基化，抑制了与Hup A合成相关基因，导致Hup A产量下降。(https://www.daowen.com)

CgClr3和CgSir2均为组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)基因。HDAC不仅与基因沉默有关(Nakayama et al.2001；Bannister et al.2001)，而且还具有基因激活功能。例如烟曲霉HDAC hda A基因的缺失增加了几种次生代谢产物的产生，但降低了胶霉质毒素的产生。而过表达的hdaA增加了胶霉毒素的产生(Lee et al.2009)。HDAC具有调控转录的作用，在细胞内HDAC与招募组蛋白乙酰化转移酶HAT密切相关(Studt et al.2013)。本研究当Cg01 HDAC被敲除后，可能降低了转录因子去乙酰化水平，导致不能招募HAT乙酰化位于Hup A生物合成相关的组蛋白，最后Hup A合成通路转录因子与合成基因结合水平下降，Hup A产量下降。随后的基因回补突变体菌株ΔCgClr4/CgClr4、ΔCgClr3/CgClr3、ΔCgSir2/CgSir2石杉碱甲产量又恢复到野生型水平。缺失和回补试验表明CgClr4、CgClr3和CgSir2具有调控Cg01合成Hup A作用。此外，在裂变酵母中HDACSir2通过对组蛋白H3K14位点去乙酰化靶向作用于HMT Clr4，从而对HMT Clr4在着丝粒处异染色质的维持与组装起着至关重要的影响(Alper et al.2013)。Stewart等研究发现H3K9甲基化也可抑制组蛋白H3和H4乙酰化，使组蛋白发生去乙酰化而抑制转录(Stewart et al.2005)。这些结果揭示了表观调控是一个极为复杂的过程，CgClr4、CgClr3和CgSir2三者是单独还是共同对Hup A合成起调控作用还需进一步研究。

本研究发现了与Hup A合成调控相关的3个表观调控基因CgClr4、CgClr3、Cg-Sir2，这是首个从表观遗传修饰的角度研究内生真菌合成次生代谢产物的报道，为构建高产Hup A菌株奠定了基础，为珍稀植物内生真菌合成调控高值化次生代谢产物的研究提供了新思路。