实验六 病原性球菌的分离与鉴定
一、实验目的
1.熟悉病原性球菌的检查程序。
2.掌握病原性球菌（金黄色葡萄球菌）的形态和分离培养法。
二、实验材料
病原性球菌的形态、脓汁标本、革兰氏染色液、普通平板、血平板、玻片、接种环、酒精灯、光学显微镜、香柏油、吸水纸、擦镜纸、标记笔。
三、实验内容
（一）病原性球菌的检查程序
病原性球菌常引起化脓性疾病，分离用标本多采用脓、痰液，但也可从分泌物、血液及穿刺液中取材。
1.标本采集：
（1）脓液：用无菌棉拭挑取患部深处脓液或分泌物放入无菌试管内。
（2）痰液：用无菌容器收集痰液，以无菌棉拭挑取痰液放入无菌试管。
（3）咽部分泌物：嘱患者张开口，用压舌板轻压舌根部，以无菌棉拭从鼻咽部位擦拭取材，然后将其放入无菌试管中。
（4）血液：高热、败血症患者作血液检样时，最好在发热时，抗菌药物治疗前采取，这时培养阳性率最高。取血3～5 ml，立即以无菌注入30～50 ml（使血与培养基之比约等于1∶10）的葡萄糖酚红肉汤增菌培养基中。
（5）脑脊液：对疑患流脑的患者做腰椎穿刺取脑脊液（CSF），脑脊液取出后应盛于无菌容器内立即送检。
（6）尿道、阴道分泌物：对可疑淋病患者，男性可从尿道取材，取材时应进入尿道1～2cm，如刚排尿，应等待1小时左右。女性则可从宫颈口取分泌物，当插入宫颈口后应稍等片刻，再旋转1～2分钟拿出，取材应立即送检。
2.分离：待检标本可直接做涂片染色检查鉴定，必要时可做分离培养及生化反应致病性鉴定。常见致病性球菌的检查程序如下（图1）。
3.病原性球菌的培养物观察：肉眼观察葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌在血琼脂平板上的生长情况及脑膜炎球菌在巧克力（色）琼脂平板上的生长情况，比较菌落的形态特征。
图1
（1）葡萄球菌：在血琼脂平板上培养18～24小时，形成圆表凸起的、表面光滑的、湿润的、边缘整齐的，菌落不透明的。金黄色葡萄球菌为金黄色，可产生透明溶血环，表皮葡萄球菌为白色，无溶血环，腐生葡萄球菌白色或柠檬色，无溶血环。
（2）链球菌：在血琼脂平板上培养18～24小时，形成灰白色、圆形凸起、半透明或不透明的细小菌落。甲型溶血性链球菌不完全溶血，在菌落周围形成草绿色溶血环，乙型溶血性链球菌完全溶血，形成透明溶血环，丙型链球菌不发生形成圆形、光滑隆起透明似露珠的菌落。在血琼脂平板上不发生溶血溶血、无溶血环。
（3）肺炎球菌：血琼脂平板上培养18～24小时，形成细小、灰白色、扁平、半透明的菌落，周围有草绿色溶血环，其与甲型溶血性链球菌相似，培养2～3天后，因菌体发生自溶，菌落中央下陷呈“脐状”。
（4）脑膜炎球菌：在巧克力（色）琼脂平板上放入含有5%的CO2，37℃环境中培养24小时，形成圆形光滑隆起透明似露珠的菌落，无溶血环。(https://www.daowen.com)
图2
（二）金黄色葡萄球菌的鉴定（血浆凝固酶试验）（图2）
四、实验原理
葡萄球菌产生的血浆凝固酶是能使含有枸橼酸钠或肝素抗凝剂的人或兔血浆发生凝固的酶类物质。凝固酶有两种，一种是分泌到菌体外的蛋白质称为游离凝固酶，作用类似凝血酶原物质，被人或兔血浆中的协同因子激活为凝血酶类物质后，可使液态的纤维蛋白原变成凝固的纤维蛋白，使血浆凝固。另一种凝固酶结合于菌体表面并不释放，称为结合凝固酶，其作用是在该菌株的表面有纤维蛋白原受体，当细菌悬浮于人或兔血浆时，纤维蛋白原与细菌的相应受体交联而使细菌凝聚。
五、实验方法
1.玻片法
（1）取干净玻片一块，用记号笔将玻片划成两格，其中一格加2接种环的生理盐水，另一格加1/2人新鲜血浆接种1环。
（2）用接种环取培养物葡萄球菌菌落少许在生理盐水内研磨成细菌悬液，然后取此悬液1环与血浆混匀。
（3）5分钟内观察结果，若有凝块出现即为阳性；若无凝块出现，则为阴性。
2.试管法
（1）按表1加入1∶4新鲜血浆及葡萄球菌肉汤培养液。
（2）将各管置37℃水浴中，每隔30分钟观察一次结果。
（3）在3小时内若第一管和第二管出现凝固，而第三管不出现凝固则为阴性。
表6-1 血浆凝固酶试验（试管法）
六、注意事项
1.标本的收集时要检查是否合格，以免影响实验结果。
2.标本的处理按程序操作。
3.玻片法凝固酶试验结果可以在显微镜下观察。
七、实验报告
1.记录血浆凝固酶试验和药敏实验结果。
2.结合系列实验结果，对病原性球菌鉴定作出结论。