实验四 溶菌酶的溶菌作用
一、实验目的
证实体液中溶菌酶的存在及溶菌酶对革兰氏阳性菌的溶解作用。
二、实验原理
溶菌酶的杀菌机理是其作用于细菌细胞壁的黏肽层，黏肽是细菌细胞壁的主要成分。溶菌酶能切断黏肽结构中的N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β -1，4糖苷键，破坏黏肽支架，破坏细胞壁。由于细菌细胞壁的重要功能之一是保护细菌，即抗低渗，故细菌失去细胞壁的保护作用后，在低渗环境中可发生溶解。溶菌酶的主要作用对象是革兰氏阳性菌。革兰氏阴性菌细胞壁黏肽层外还有脂多糖、外膜和脂蛋白结构，故在一般情况下溶菌酶不易发挥直接作用。
三、实验材料
1.葡萄球菌：是一种革兰氏阳性菌，普通琼脂培养基生长良好。
2.溶菌酶：称取溶菌酶标准纯品，用1/15 mol/L PBS配制为1000μg/ml原液，并稀释为100μg、50μg、10μg/ml标准液，用前保存在冰箱中。用于阳性对照及制备标准曲线。
3.唾液：用无菌平皿收集唾液，可在同学间收集。
4.其他：无菌打孔器（孔径2 mm）、无菌毛细吸管、毫米尺等。(https://www.daowen.com)
四、实验方法
1.用无菌打孔器在葡萄球菌琼脂平板上打孔，用针头挑出孔内琼脂，孔径2 mm左右，孔距5～20 mm。
2.用毛细吸管取新鲜收集的唾液加入琼脂孔内，每孔加一滴，每滴约有0.025 ml，同时加标准溶菌酶作阳性对照。
3.置于24℃～28℃环境下12～18小时观察结果。
五、实验结果
1.用毫米尺或三角板量取小孔周围溶菌环直径，并作记录，可与标准溶菌酶阳性对照作对比观察。
2.如需定量测定检品（唾液）中的溶菌酶含量，可将上述各种稀释度的溶菌酶标准溶液，分别加入小孔中，同法测定溶菌环直径，用半对数纸制成标准曲线，检品中的溶菌酶含量可从标准曲线上查出（图1）。
图1 溶菌酶实验结果（对应彩图9）