抗病毒治疗对乙型肝炎重症化进程中免疫应答的影响
陈韬
近年来，乙型肝炎的抗病毒治疗取得了令人瞩目的进展，核苷(酸)类似物(nucleoside(acid)analogues，NAs)等药物的研发和面市，临床获益甚多。这些药物能有效抑制病毒复制，从而控制疾病进展，显著改善预后，大大降低了与HBV感染相关的肝硬化和肝癌的发生率。但抗病毒治疗对机体免疫系统的影响及其与肝病进展之间的关系尚未完全阐明。
乙型肝炎重症化进程中宿主免疫系统发生了很大的变化，越来越多的研究结果表明抗病毒治疗除具有直接的抑制病毒作用外，还有助于重塑机体的免疫应答。
一、抗病毒治疗对乙型肝炎重症化进程中固有免疫的影响
1.树突状细胞
CHB患者外周血髓样DC(myeloid DC，mDC)、单核细胞来源的DC(monocyte derived DC，moDC)、浆细胞样DC(plasmacytoid DC，pDC)、表面共刺激分子(CD80、CD83、CD86及CD40)和TLRs(尤其是TLR-3和TLR-9)表达低下，TLR-3、TLR-9的配体刺激IL-12、Ⅰ型IFN分泌减少，T淋巴细胞程序性死亡分子配体1(programmed death ligand 1，PD-L1)的表达上调，DC激活淋巴细胞的能力明显减弱。然而也有部分研究提示CHB患者的外周血DC功能未受到明显影响，在肝炎活动期肝脏组织中提取的DC，其表面共刺激分子和IFN的表达甚至有所增强。造成研究结果有差异的可能原因如下：①研究对象处于不同的HBV免疫活动阶段；②DC有向炎症反应部位聚集的倾向，肝脏组织中分布的DC功能不同于外周DC。但迄今为止，大多数研究支持外周血DC功能受到HBV的影响。
HBsAg与血液树突状细胞抗原-2(blood dendritic cells antigen-2，BDCA-2)结合，通过减少干扰素调节因子-7(interferon regulatory factor-7，IRF-7)的表达和核转位，以剂量依赖形式抑制TLR-9介导的IFN分泌。LPS和Pam3cys诱导TLR-2/4信号转导通路中p38激酶的磷酸化，而HBeAg能够抑制该蛋白磷酸化，从而减少TNF-α的生成。
干扰素治疗获得病毒学应答者，外周血DC数量增加，表达Th1型细胞因子的能力得到改善，抗原呈递能力增强，同样的情况见于阿德福韦和替比夫定治疗者。IFN在治疗病毒性肝炎中具有免疫调控和抗病毒作用。早期认为IFN可增加CTL的活性和MHC抗原在肝细胞表面的表达，这种双重识别机制支持了特异性CTL在免疫清除 HBV中的作用。近期认为IFN-α在固有免疫中发挥重要作用，产生IFN的自然IFN生成细胞(NIPC)、浆细胞样DC(pDC)和成熟DC在抗原呈递和T淋巴细胞、B淋巴细胞活化过程中发挥重要作用。
抗病毒治疗改善DC表型和功能的机制尚不清楚，推测可能与降低病毒抗原对信号转导通路的抑制有关，依此理论，在抗病毒治疗期间病毒抗原需要迅速下降才能改善DC功能。研究发现，使用NAs治疗3个月DC功能即有变化，但血清HBsAg滴度无法在NAs治疗3个月内下降1×102 copies/mL以上，所以DC功能变化可能存在其他机制。干扰素对免疫细胞有直接调节作用，NAs也可能直接作用于DC。在接近人体血药浓度的条件下，拉米夫定、恩替卡韦刺激DC后，DC表面共刺激分子表达增加，激活淋巴细胞能力增强，但NAs是否具备直接免疫调节功能还需进一步验证。
NAs和干扰素改善DC功能的作用毋庸置疑。随着病毒复制得到控制，DC直接分泌具有抗病毒作用的炎症因子，或者通过活化T淋巴细胞，以非溶细胞性方式进一步抑制病毒，DC导致的肝脏炎性损伤减轻，CHB重症化的进程被打断。通过抗病毒治疗，DC部分炎症因子表达升高，肝损害却减轻，如何解释这一现象？现认为Th1型CD4+T淋巴细胞应答并不一定意味着“促炎”和炎性损伤，相反IFN-γ和IL-12对抑制自身免疫性中枢神经系统脱髓鞘病变至关重要，说明在CHB患者中，Th1型应答的主要作用是产生抗病毒效应。Th17应答主要针对细菌或真菌感染，其作用可能以炎性损伤为主。DC对CD4+T淋巴细胞分化应答十分重要，DC分泌的IL-4、IL-12、IL-23分别促进不同类型Th细胞应答，不同类型Th细胞应答间又相互拮抗。由于DC功能受到调节，其分泌的细胞因子产生变化，CD4+T淋巴细胞在免疫微环境的调节下产生分化差异，但是否由此减轻了肝脏炎性损伤还有待证实。
2.NK细胞与NKT淋巴细胞
CHB患者中，NK细胞杀伤功能相对完好，但分泌IFN-γ、TNF-α等抗病毒因子的能力严重减弱，提示NK细胞参与肝脏持续损伤过程却无法有效抑制病毒，NKT淋巴细胞分泌IFN-γ也减少。免疫激活期的CHB患者NK细胞的细胞杀伤活性有所增强，并与肝组织学炎症活动度及ALT水平相关，但IFN-γ的表达无提升。采用恩替卡韦治疗后NK/NKT淋巴细胞的表型和功能得到改善，IFN-γ表达增加，细胞毒性的TRAIL表达下降，NK细胞改善程度与ALT水平下降程度相关。研究发现，干扰素治疗有效患者肝内NK/NKT淋巴细胞数量下降，干扰素治疗无应答患者肝内NK/NKT淋巴细胞数量反而升高，进一步说明NK/NKT淋巴细胞在CHB患者中的主要作用是引起肝损害，而对控制病毒复制意义不大，抗病毒治疗减少了NK/NKT淋巴细胞引起的肝损害。
Woltman等研究表明高病毒载量的CHB患者体内NK细胞的活化及杀伤作用减弱，特别是CD56dim NK细胞，其表面的抑制性受体NKG2A的表达上调，而活化性受体CD16和NKp30的表达下调，经过NAs抗病毒治疗后，患者体内NK细胞的活化和功能得到恢复，提示NAs可通过免疫调节发挥抗病毒作用。宁琴等研究发现，HBeAg阳性的慢性乙型肝炎患者口服替比夫定治疗48周后，患者外周血中CD56bright NK细胞的频数增加，NK细胞表面的活化受体NKp46和NKG2D的表达上调，并且伴随抑制受体NKG2A的表达下调，同时NK细胞分泌IL-15功能增强。尤其在HBeAg发生血清学转换的患者中，其外周血中的CD56bright NK细胞明显上调，分泌IL-15的能力明显增强。NAs在抑制病毒的复制过程中还可以缓解机体的免疫抑制状态，研究发现接受替诺福韦酯治疗的患者，外周血单个核细胞的干扰素信号通路上调，在采用恩替卡韦进行治疗的CHB患者中，体内NK细胞分泌IFN-γ的水平得到改善，并且在阿德福韦酯和拉米夫定联合治疗的研究中发现NK细胞表达的TRAIL下降，提示NAs可改善CHB患者NK细胞介导的免疫损伤，延缓CHB重症化的进展。
IFN-α主要通过诱导ISGs来发挥抗病毒作用，在免疫调节方面，IFN-α主要上调CD56bright NK细胞的比例和表面的活化性受体NKP46、NKG2C+等的表达来发挥抗病毒的天然免疫作用，同时IFN-α还可以增强NK细胞分泌IFN-γ功能，下调Treg数量。IFN-α抗病毒治疗对HBV特异性T淋巴细胞功能的恢复欠佳也许受限于其免疫调节效应，同时肝内长期的慢性炎症和免疫耐受状态对T淋巴细胞功能也有一定影响。同时，该队列研究发现HBeAg阳性的CHB患者接受PEG-IFNα-2a治疗12周后，HBV持续免疫应答较好的患者体内HBsAg的水平下降明显，伴随着外周血Treg比例的下降，同时患者外周血中NKG2C+ NK细胞和TLR2+单核细胞频数上调，提示IFN可通过改善针对HBV的非特异性免疫应答来发挥抗病毒作用。
3.其他固有免疫组成成分
肝脏实质/非实质细胞表达的模式识别受体能有效介导抗HBV的固有免疫反应。HBV进化出相应的对策，抑制肝实质/非实质细胞β-干扰素的产生，还抑制了IRF3、NF-κB的活性。转染HBV的肝细胞系MHC-Ⅰ类分子表达下降，因而可能更易受到NK细胞攻击。肝细胞、肝窦内皮细胞、Kupffer细胞PD-L分子表达上调，抑制了HBV特异性T淋巴细胞应答。目前，尚未见到有关抗病毒治疗改善上述固有免疫组分的研究。
二、抗病毒治疗对乙型肝炎重症化进程中适应性免疫的影响
乙型肝炎重症化是一个复杂的过程，其机制至今未能完全阐明。目前认为，乙型肝炎重症化主要由宿主免疫系统对HBV感染的过度应答(免疫亢进)所引起。肝组织在乙型肝炎重症化过程中依次经受免疫损伤、缺血缺氧和内毒素血症三重致命性打击。其具体步骤如下：①HBV的高度复制及其蛋白抗原在肝细胞表面的表达，诱发以细胞毒性T淋巴细胞(CTL)为主要效应细胞的细胞免疫反应，同时产生大量TNF-α，通过多种途径导致肝细胞坏死和凋亡，介导了局部炎症反应；②局部炎症导致微循环障碍，造成肝组织缺血缺氧及再灌注损伤；③诱发内毒素血症，通过炎性介质/细胞因子(如TNF-α、IL-1、IL-10等)介导加速肝细胞死亡或凋亡。虽然大多数情况下HBV不直接损伤肝细胞，感染HBV后发生肝组织损害的决定因素是HBV 抗原诱发的继发性免疫损伤，但HBV作为HBV相关性重型肝炎(肝衰竭)的病原体，在该病的发病过程中起着始动或主导作用。也就是说，目前公认的是，免疫学因素和非免疫学因素均起着重要作用，HBV在机体内持续复制而诱发过强的免疫应答是导致肝细胞大量坏死的主要致病机制。在疾病早期进行抗病毒治疗是终止剧烈细胞免疫和体液免疫的首要而关键的环节。因此，抗病毒治疗已成为目前治疗乙型重型肝炎的一种行之有效的治疗手段，核苷(酸)类似物抗病毒治疗所取得的效果足以证明这一点。
1.抗病毒治疗对乙型肝炎适应性免疫反应的影响
(1)拉米夫定和乙型肝炎的适应性免疫反应：抗病毒治疗有利于抑制HBV复制，减轻肝损害和减缓疾病进展。研究显示，在抗病毒治疗的同时，肝脏本身的抗病毒免疫反应对治疗的应答起决定性作用。例如，在拉米夫定治疗早期，CD4+T淋巴细胞反应性增加，但6个月后又恢复到治疗前水平，HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞反应也不能长期维持，因而患者对抗病毒治疗应答性不佳。阿德福韦酯虽然可以更好地抑制HBV复制，提高CHB患者的mDC功能，但不能使CD4+T淋巴细胞功能完全恢复，抗病毒治疗仍不能产生长期、持续的病毒学反应。
有研究发现，CHB患者经过拉米夫定治疗后，可见到pDC数量增加，所以，以pDC为主的固有免疫应答可能影响了抗病毒治疗的效果。IFN-α具有抗病毒和调节免疫的双重功效，IFN-α治疗可诱导HBcAg特异性的T淋巴细胞增殖和强烈的肝内CD8+T淋巴细胞反应，包括分泌IFN-γ的CD8+T淋巴细胞增加，这些都可通过溶细胞和非溶细胞的机制抑制和清除HBV，但不能诱导CD4+T淋巴细胞和NKT淋巴细胞反应。一项对31例接受重组IFNα-1b抗病毒治疗的CHB患者的mDC和pDC频率和功能的动态研究发现，完全应答者的循环pDC数量和在CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)刺激下pDC产生的IFN-α量在早期下降，然后迅速恢复，而在无应答者中无此变化。外周pDC数量的最初迅速降低可能是pDC迁移到了肝脏，在肝脏发挥非特异性抗病毒作用。亦有关于IFN治疗能明显提高应答者肝内CD8+T淋巴细胞数量和肝脏巨噬细胞上CD14表达的报道，认为IFN治疗可广泛地募集外周包括pDC在内的免疫细胞到肝脏，以加强病毒清除和减少潜在的肝损害。特别是IFN治疗2周后，完全应答者的pDC数量增加，pDC产生的IFN仅在12周左右达到峰值，同时伴随着HBV清除、HBeAg血清学转换和循环mDC数量和Th1因子水平的提高。虽然CHB患者对IFN治疗的应答性取决于很多因素，如HBV基因型、治疗前的HBV DNA水平和ALT水平等，但上述研究结果提示治疗12周后pDC功能和频率的恢复可能是预测IFN治疗效果的指标之一。
有学者还研究了拉米夫定抗病毒治疗前后CHB患者外周血HBV特异性辅助性T淋巴细胞频率的变化及与血清HBV DNA的关系。该研究选择25例轻、中度CHB患者，在抗病毒治疗前、后，用重组人HBeAg作为刺激抗原，采用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测外周血分泌IFN-γ的HBV特异性辅助性T淋巴细胞的频率，同时，用实时荧光定量PCR定量检测患者血清HBV DNA水平。结果CHB轻、中度患者治疗前外周血HBV特异性辅助性T淋巴细胞为(47.30±25.50)SFCs/1×106 PBMC，拉米夫定抗病毒治疗3个月后显著降低。8例CHB轻、中度患者抗病毒治疗前HBV特异性辅助性T淋巴细胞频率均高于治疗后；其中6例患者抗病毒治疗后血清HBV DNA载量显著降低，另外2例患者血清HBV DNA水平没有下降，血清HBV DNA水平下降的患者(除1例外)治疗前HBV特异性Th细胞频率高于血清HBV DNA水平无下降的患者。该研究得出的结论是轻、中度CHB患者炎症期HBV特异性Th细胞反应高于炎症缓解期。
(2)恩替卡韦与乙型肝炎的适应性免疫反应：有学者研究了恩替卡韦治疗48周过程中CHB患者外周血单个核细胞(PMBCs)中Th1及Th2类细胞的变化。9例CHB患者在应用恩替卡韦治疗的开始及第4、12、24、36、48周时取静脉血，分离血清及PMBCs，检测血清中HBV表面标志物(HBV-M)、HBV DNA载量及ALT水平；行细胞内细胞因子染色，应用流式细胞仪检测PMBCs中Th1及Th2类细胞频数。结果显示，应用恩替卡韦治疗后CHB患者ALT水平及HBV DNA载量从第4周开始出现明显下降，至第48周时与正常对照组无明显差异；表型为CD3+ CD4+ IFN-γ+的Th1类细胞的频数在第4周时明显升高，其后逐渐下降，在第48周时接近并稍低于基线点，但高于正常对照组。表型为CD3+ CD4+ IL-4+的Th2类细胞的频数明显升高，在第12周时达到峰值，其后明显下降，明显低于正常对照组。提示恩替卡韦在有效抑制病毒复制的同时，体内Th1类免疫反应下降而Th2类免疫反应不足，提示体内炎症反应减轻，但同时机体清除病毒的能力也被削弱。
国内的一项研究发现，慢性乙型重型肝炎患者早期口服恩替卡韦治疗后，其体内T淋巴细胞的亚群失衡及细胞免疫调控紊乱状态得到改善，治疗24周后患者外周血CD4+T淋巴细胞亚群数量增加，CD4+/CD8+值显著升高，与患者肝功能指标明显改善和病毒载量下降等结果一致。张继承等研究发现，慢性乙型重型肝炎患者接受核苷(酸)类似物抗病毒治疗后CD4+CD25+调节性T淋巴细胞(Treg)比例下降，与患者病情好转一致，而死亡组Treg的比例随着病情的恶化呈上升趋势，说明患者接受核苷(酸)类似物抗病毒治疗后其体内Treg的比例的变化可反映患者的预后。
(3)替比夫定与乙型肝炎的适应性免疫反应：许多研究发现替比夫定对CHB患者外周血中多种免疫因子具有影响，由此推断替比夫定可能具有免疫调节作用。为探讨替比夫定高血清学转换现象的作用机制，许多学者进行了替比夫定在免疫调节方面的研究。
有研究结果显示，在36例接受替比夫定治疗的CHB患者中，外周血调节性T淋巴细胞(Treg)比例显著降低，这有助于解除Treg对HBV特异性T淋巴细胞功能的抑制，促进机体产生特异性抗HBV免疫应答。
有研究发现，接受替比夫定治疗的CHB患者中，完全应答的患者Th1类细胞因子水平明显增高，Th2类细胞因子水平显著降低；因此，Th1类细胞主导的免疫应答在清除HBV感染中起到重要作用。亦有近期研究表明，通过替比夫定治疗获得HBeAg阴转或HBeAg/抗-HBe血清学转换的患者，其CD8+T淋巴细胞上PD-1分子的表达水平显著下降。
另一项研究发现，CHB患者外周血中CD3-CD56+自然杀伤细胞(NK细胞)数目少于健康人，但外周血CD3+ CD4+T淋巴细胞、Treg、CD4+与CD8+细胞比例较正常对照组高。53例CHB患者接受替比夫定治疗48周后，外周血CD3-CD56+NK细胞及表达2B4+的NK细胞较治疗前明显增多。由此推断替比夫定可能通过调节CHB患者外周血中2B4+、CD56+NK细胞等的浓度，促进NK细胞对靶细胞的识别，从而起到免疫调节作用。
CHB患者在口服替比夫定进行抗病毒治疗并发生HBeAg血清学转换后，体内HBV特异性滤泡辅助性T淋巴细胞的数量较未发生HBeAg血清学转换的患者多。
有学者用MHV-3感染的重型肝炎小鼠模型研究了替比夫定对疾病转归、病毒复制和免疫细胞应答的影响，结果表明，替比夫定可显著降低小鼠死亡率；替比夫定对巨噬细胞内MHV-3的复制没有影响，但可以促进巨噬细胞表达TNF-α及IL-12；在体内可促进Th1类细胞因子的分泌，抑制Th2类细胞因子的产生。
(4)阿德福韦和替诺福韦与乙型肝炎的适应性免疫反应：阿德福韦由于抗病毒作用较弱及肾脏毒性等问题，一般很少用于HBV相关重型肝炎患者的治疗，目前多将其他核苷(酸)类似物联合应用作为耐药患者的治疗方案，其对适应性免疫的影响研究较少。曾有一些相关研究报道，但多缺乏很好的对照。
2.抗病毒治疗对HBV特异性细胞毒杀伤作用的影响
根据目前的认识，细胞毒性淋巴细胞介导的细胞免疫反应，在清除乙型肝炎病毒和损害肝细胞两个密切相关的过程中扮演重要角色，因此，也极有可能在乙型重型肝炎的发生中起重要作用。
(1)干扰素治疗对CTL的影响：Rehermann等将研究人群分成8个组，包括干扰素完全应答组、干扰素部分应答组、干扰素无应答组、未经治疗的慢性乙型肝炎组、自发完全清除HBV组、自发部分清除HBV组、急性乙型肝炎组及正常对照组。选取5个HBV表位肽诱导培养HBV抗原特异性CTL，测定细胞杀伤能力，研究显示在急性乙型肝炎组出现最强的应答效应，干扰素完全应答组和自发完全清除HBV组的CTL效应也明显强于其他各组。推测在CHB患者中可通过干扰素治疗或自发地引起特异性CTL活性增强而达到清除病毒的目的，这种效应与急性乙型肝炎时类似，因此认为，通过刺激CTL应答的特异性治疗是促进CHB患者病毒清除和机体恢复的一种有效途径。
Bush等认为高亲和力特异性CTL较低亲和力特异性CTL更早期、更迅速地产生应答效应，因此，选择性地扩增高亲和力特异性CTL，增加记忆T淋巴细胞池中此类CTL的前体细胞，能有效改善抗病毒应答。
IFN虽然可以恢复CHB患者针对HBV的固有免疫应答，但是对HBV适应性免疫应答影响较小。Amalia等研究发现HBeAg阴性的CHB患者接受IFN-α治疗后，体内HBV特异性T淋巴细胞的免疫应答功能未得到恢复。Lorenzo等研究发现HBeAg阴性的CHB患者接受IFN-α治疗后，体内CD8+T淋巴细胞的比例下降，HBV特异性CD8+T淋巴细胞的功能也未能恢复。尽管在IFN-α治疗过程中并未发现患者体内HBV特异性T淋巴细胞功能有所恢复，但与无应答的患者相比，发生HBeAg或HBsAg血清学转换的免疫应答患者外周血中CD8+T淋巴细胞增殖能力更强。
(2)核苷(酸)类似物(NAs)对CTL的影响：Boni等研究6例HLA-A2+的CHB患者，发现接受拉米夫定治疗期间，患者HBV DNA载量和HBeAg均不同程度下降，同时外周血特异性CTL的数量和其杀伤靶细胞能力较治疗前分别明显增多和增强，且与HBV DNA载量下降同步，但并未出现ALT水平的急剧上升。可能的机制如下：①拉米夫定抗病毒治疗使受感染靶细胞(肝细胞)数量减少，从而降低CTL的杀伤作用；②肝脏炎症减轻导致肝内和外周血中效应CTL重新分布；③细胞因子(主要为IFN-γ和TNF-α)介导的非溶细胞性抗病毒作用增强。治疗中还发现特异性CD4+T淋巴细胞应答功能改善，且与病毒血症减轻相伴随，提示经拉米夫定治疗后，HBV特异性CD8+CTL的应答增强与患者体内病毒抗原负荷降低和CD4+T淋巴细胞功能改善有关。Kondo等也发现，经拉米夫定治疗后，CHB患者HBV抗原特异性CTL应答增强，分泌IFN-γ增多。Tsai等对36例分别接受IFN-α、胸腺肽-α和拉米夫定治疗的CHB患者研究发现，经治疗3个月后，显效组的外周血特异性CTL数量、靶细胞杀伤能力以及表达IFN-γ的能力显著高于部分显效组和未显效组。Zhou等针对接受阿德福韦治疗12个月后的CHB患者研究发现，其HBV特异性CTL数量较治疗前显著升高(0.68%±0.11% vs. 0.33%±0.11%，p＜0.001)，并且，发生血清学转换的患者HBV特异性CTL数量较未发生血清学转换者显著升高(0.86%±0.05% vs. 0.61%±0.07%，p＜0.001)，说明阿德福韦能增强CHB患者HBV特异性的细胞免疫应答，经阿德福韦治疗后，HBeAg血清学转换水平与HBV抗原特异性CTL相关。Naoumov等人研究发现HBeAg阳性CHB患者接受替比夫定或拉米夫定治疗后，针对HBV特异性CD8+T淋巴细胞表面的PD-1表达下调，有助于T淋巴细胞功能的恢复。Ferrari等研究发现，未经抗病毒治疗的患者体内NK细胞过表达TRAIL、CD38和Ki67，TRAIL+NK细胞可抑制CD4+细胞的功能，经过NAs治疗后，患者体内HBV特异性T淋巴细胞的功能有所恢复，TRAIL+NK细胞频数减少，临床上可以通过改变NK细胞的表型来提高机体对HBV的免疫应答，这为提高NAs的抗病毒疗效提供新思路。
目前尚缺乏乙型重型肝炎患者经抗病毒治疗后HBV抗原特异性CTL应答变化及与重型肝炎预后的关系研究。HBV抗原特异性CTL免疫机制，可能是乙型重型肝炎发病机制的中心环节。通过建立有效的实验研究方法，深入研究和探讨抗病毒治疗对HBV特异性细胞毒杀伤作用的影响、特异性细胞免疫机制在HBV清除和细胞损伤中的作用及两者之间的相互关系，从而获得乙型重型肝炎防治的新启发和对策，是当前具有前景的研究方向。
三、抗病毒治疗对相关细胞因子的影响
1.IFN-γ
研究显示，慢加急性肝衰竭(ACLF)患者组与CHB患者组和正常对照组相比，肝内促炎症因子IFN-γ表达水平上调，IFN-γ过度表达与CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的募集明显相关。
拉米夫定治疗CHB患者52周的研究中，用酶联免疫吸附方法分别检测在治疗前，治疗后第13、26、39周以及52周时的血清IFN-γ等细胞因子水平，结果发现拉米夫定治疗后完全应答组的IFN-γ水平逐渐增高。拉米夫定和替比夫定治疗CHB肝硬化患者24周，检测到血清IFN-γ水平逐渐升高，IFN-γ在治疗24周的水平较治疗12周的水平升高，治疗12周的水平较治疗前的水平显著升高。另有研究检测了CHB患者在应用拉米夫定治疗前后PBMC经植物血凝素刺激分泌IFN-γ水平的变化，结果发现CHB患者治疗前PBMC分泌IFN-γ水平显著低于正常对照组，拉米夫定治疗后HBV高、中载量组分泌IFN-γ水平较治疗前显著升高，患者IFN-γ水平变化与HBV DNA载量呈负相关(r=0.89，p<0.001)。
对HBeAg阳性CHB患者采用替比夫定治疗48周，在基线与治疗4、8、12、24及48周时用流式细胞仪检测外周血中IFN-γ等细胞因子的表达水平，在完全应答组内IFN-γ水平自服用替比夫定12周起及其后各时间点较基线时显著升高；在部分应答组内从服药24周起IFN-γ水平较基线时显著升高(p<0.05)。
在阿德福韦治疗HBeAg阳性CHB患者过程中，血清IFN-γ水平表现为先升高再下降的过程，完全应答组治疗16周时IFN-γ水平显著高于部分应答组和正常对照组，而部分应答组与正常对照组相比，差异无统计学意义。阿德福韦治疗CHB患者24周的研究中，在治疗前、治疗12周和治疗24周检测Th细胞分泌细胞因子水平，IFN-γ水平显著低于正常对照组，阿德福韦治疗后IFN-γ水平逐渐升高，治疗12周起与正常对照组无差异，治疗24周时显著高于正常对照组。另有研究也发现阿德福韦治疗CHB患者48周后，血清IFN-γ水平较治疗前升高。
用IFN-α治疗CHB患者24周，患者外周血单个核细胞(PBMC)经植物血凝素刺激分泌的IFN-γ水平在治疗前、治疗后4周、治疗后12周及治疗后24周无明显变化。
总之，在采用不同抗病毒药物治疗后，多可见患者血清IFN-γ水平升高。IFN-γ可以激活单核-巨噬细胞，诱导和增加MHC分子的表达，促进T淋巴细胞分化，上调NK细胞的杀伤作用，有助于HBV的清除，但是过强的免疫应答会导致暴发性肝炎，使病情重症化。
2.TNF-α
慢加急性肝衰竭患者肝内促炎症因子TNF-α表达水平上调，可能与Kupffer细胞的增加相关。
CHB患者血清TNF-α表达水平较正常对照组高，拉米夫定可显著下调血清TNF-α水平。但是也有不同的研究结果：拉米夫定治疗12个月，血清TNF-α水平升高，完全应答组血清TNF-α水平较无应答组显著升高。
替比夫定治疗HBeAg阳性CHB患者48周，在完全应答组内TNF-α水平自服用替比夫定12周起及其后各时间点较基线均显著升高。
阿德福韦治疗CHB患者24周的研究中，CHB患者组基线TNF-α水平显著低于正常对照组。阿德福韦治疗后TNF-α水平逐渐升高，治疗12周起与正常对照组无差异，治疗24周时高于正常对照组，但差异无统计学意义。
尽管上述研究有不同的结果，但从理论上讲，抗病毒治疗后，早期病毒清除，炎症可加剧，血清TNF-α水平升高，后期病毒载量低于检测下限，炎症可减轻，血清TNF-α水平相应下降。
3.IL-2
替比夫定治疗HBeAg阳性CHB患者48周，完全应答组的IL-2水平自替比夫定治疗12周起及其后各时间点较基线均显著升高。
阿德福韦治疗CHB患者24周的研究中，治疗前IL-2水平低于正常对照组，阿德福韦治疗后IL-2水平逐渐升高，治疗12周起与正常对照组无差异。而在另一项阿德福韦治疗CHB患者48周的研究中，也有类似结果，血清IL-2水平较治疗前显著升高。
IL-2由CD4+Th1类细胞产生，抗病毒后IL-2水平升高可能提示CHB患者抗病毒治疗后Th1类细胞功能有所恢复。
4.IL-4
拉米夫定治疗CHB患者52周的研究发现，拉米夫定治疗后完全应答组IL-4水平逐渐降低。拉米夫定和替比夫定治疗CHB肝硬化患者24周的研究中，患者血清IL-4水平逐渐下降，IL-4水平在治疗12周的水平较治疗前的水平显著降低，而治疗24周的水平较治疗12周的水平降低，但差异无统计学意义。
替比夫定治疗HBeAg阳性CHB患者48周的研究发现，病毒学突破组自服药24周起的IL-4水平与基线相比逐渐升高。
阿德福韦治疗CHB患者24周的研究中，在治疗前IL-4水平低于正常对照组，而在阿德福韦治疗后IL-4水平逐渐升高，治疗12周起与正常对照组无差异，治疗24周时高于正常对照组。而另一项阿德福韦治疗HBeAg阳性CHB患者132周的研究中，血清完全应答组IL-4水平在治疗过程中逐渐下降，部分应答组变化不大。
IFN-α治疗CHB患者24周后，CHB患者外周血单个核细胞(PBMC)经植物血凝素刺激分泌IL-4水平较正常对照组高，并且在治疗过程中逐渐下降。
抗病毒治疗后，如果应答良好，IL-4水平逐渐下降，如果出现病毒性突破，IL-4水平可出现升高。
5.IL-6
一项纳入154例CHB患者的研究发现，血清IL-6水平与ALT水平呈负相关，CHB患者血清IL-6水平高于免疫耐受患者，是HBV临床进展的较好标志物。
CHB患者IL-6表达水平较正常对照组高，拉米夫定可显著下调IL-6。有学者研究CHB患者拉米夫定治疗前后外周血单个核细胞(PBMC)经植物血凝素刺激分泌IL-6水平的变化，治疗前CHB患者PBMC分泌IL-6水平显著高于正常对照组，拉米夫定治疗后HBV高、中载量组分泌IL-6的水平较治疗前显著降低，IL-6水平变化与HBV DNA载量和ALT呈正相关(分别为r=0.92，p<0.001；r=0.74，p<0.001)。拉米夫定和替比夫定治疗CHB肝硬化患者24周，血清IL-6水平在治疗前、治疗12周和治疗24周时变化不大，差异无统计学意义。
替比夫定治疗HBeAg阳性CHB患者48周的研究发现，无应答组在治疗48周时IL-6水平较基线时明显升高(p<0.05)，病毒学突破组自服药12周起的IL-6水平与基线相比，逐渐升高(p<0.05)。
阿德福韦治疗CHB患者24周的研究发现，在治疗前IL-6水平低于正常对照组，而在阿德福韦治疗后IL-6水平逐渐升高，治疗12周起与正常对照组无差异，治疗24周时高于正常对照组。但也有研究发现阿德福韦治疗CHB患者48周后，血清IL-6水平较治疗前下降。IL-6水平在炎症时往往升高，经抗病毒治疗，炎症好转后，多数CHB患者血清IL-6水平下降。
6.IL-8
拉米夫定和替比夫定治疗CHB肝硬化患者24周，血清IL-8水平逐渐下降，IL-8在治疗24周的水平较治疗12周的水平降低，治疗12周的水平较治疗前的水平显著降低。CHB患者IL-8表达水平较正常对照组高，拉米夫定治疗36周可显著下调IL-8。
7.IL-10
替比夫定治疗HBeAg阳性CHB患者48周的研究发现，无应答组在治疗48周时IL-10水平较基线时明显升高。
阿德福韦治疗CHB患者24周的研究发现，在治疗前IL-10水平低于正常对照组，而在阿德福韦治疗后IL-10水平逐渐升高，治疗12周起与正常对照组无差异，治疗24周时高于正常对照组，但差异无统计学意义。但也有不同的研究结果，即阿德福韦治疗CHB患者48周后，血清IL-10水平较治疗前显著下降。
在一项恩替卡韦治疗CHB患者48周的研究中，血清IL-10水平逐渐下降，至48周时达(78.12±24.01)pg/mL，仍高于正常对照组的(64.97±15.51)pg/mL(t=2.823，p<0.05)。
IL-10为免疫抑制因子，可抑制Th1类细胞应答及细胞因子合成，抗病毒治疗后IL-10水平应下降，Th1类细胞功能有所恢复。
8.IL-17
在一项恩替卡韦治疗CHB患者48周的研究中，给予CD3/CD28细胞和HBcAg两种刺激PBMC分泌的细胞因子，血清及刺激后血清中IL-17水平在治疗第4周出现显著升高(p<0.05)。IL-17是重要的促炎性细胞因子，具有强大的募集中性粒细胞的能力，由于其是近年来新发现的细胞因子，在这方面的研究资料还不是很多。抗病毒治疗初期，免疫耐受被打破，病毒清除，炎症加剧，病毒载量低于检测下限后，清除对象减少，炎症应该减轻，从长期看IL-17水平可能下降。
9.IL-18
在一项拉米夫定和替比夫定治疗CHB肝硬化患者24周的研究中，血清IL-18水平先升后降，治疗12周的水平较治疗前的水平显著升高，治疗24周的水平较治疗12周的水平低，差异无统计学意义，但较治疗前显著升高。血清IL-18在治疗后的水平较治疗前的水平显著升高。另有一项研究发现，慢性乙型重型肝炎患者采用保肝及退黄治疗后血清IL-18水平下降，而加用恩替卡韦的治疗组较对照组下降更明显。
10.IL-22
在一项恩替卡韦治疗CHB患者48周的研究中，血清IL-22水平治疗4周时升高至(85.22±38.37)pg/mL，但仍明显低于正常对照组的(161.93±42.22)pg/mL(t=2.272，p<0.05)。
11.Th1、Th2和Th17分泌的细胞因子
一项拉米夫定治疗CHB患者52周的研究发现，治疗后完全应答组IFN-γ/IL-4水平接近或高于对照组；部分应答组和无应答组IFN-γ/IL-4水平则低于对照组。拉米夫定治疗CHB过程中，随着治疗时间的延长，CHB患者Th1类细胞因子IFN-γ水平逐渐增高，Th2类细胞因子IL-4水平逐渐降低，提示拉米夫定治疗CHB不但能抑制病毒繁殖，而且长时间治疗可能增强Th1类细胞优势应答，抑制Th2类细胞功能。
替比夫定治疗HBeAg阳性CHB患者48周的研究中，通过比较完全应答组、部分应答组、无应答组、治疗中病毒学突破组在不同治疗时间点的Th1/Th2分泌的细胞因子水平，发现完全应答组的Th1类细胞因子水平高于部分应答组、无应答组及治疗中病毒学突破组；而Th2分泌的细胞因子水平则低于其他各组，但各组之间的差异无统计学意义。研究结果提示Th1/Th2分泌的细胞因子的活性平衡与替比夫定治疗HBeAg阳性CHB患者的转归有一定相关性，这可能与替比夫定治疗对CHB患者的免疫应答有一定程度的恢复作用有关。
阿德福韦治疗CHB患者24周的研究发现，治疗后各个时间点，Th1/Th2分泌的细胞因子水平逐渐上升，完全应答组细胞因子水平高于部分应答组。阿德福韦抗病毒治疗，可明显调节Th1/Th2分泌的细胞因子的表达水平，打破了CHB患者原有的免疫耐受，重建了CHB患者的免疫功能。另一项阿德福韦治疗HBeAg阳性CHB患者132周的研究发现，完全应答组和部分应答组的Th1/Th2分泌的细胞因子水平均有所上升，但完全应答组升高更显著。
CHB患者肝脏内CD4+Th应答(Th17和Th1)在免疫调节中起重要作用，非特异性的Th17和Th1应答与HBV相关的肝脏炎症和肝细胞损害药物可能有关，特别是Th17的应答可能加重肝脏炎症而导致肝衰竭。其中IL-17介导的肝脏中性粒细胞募集产生IL-8是CHB患者肝损伤的潜在机制。最近研究发现在CHB患者中Th17和调节性T淋巴细胞(Treg)数量增加，其研究对象为CHB患者30例、慢加急性肝衰竭30例和正常对照组30例，通过胞内细胞因子染色的方法分析Th17和Treg的频数。从PBMC中纯化CD4+CD25+Treg，与CD4+CD25-的T淋巴细胞共培养48h，ELISA法检测上清的IFN-γ和IL-17A，结果发现慢加急性肝衰竭患者中Th17和FoxP3+的Treg增加，CD4+T淋巴细胞分泌的IL-17A不被Treg调节，而且Treg会明显抑制IFN-γ的产生。最重要的是，Th17和Treg的比例与慢加急性肝衰竭患者的生存率相关，可作为疾病预后的评价指标。另有研究发现，对慢加急性肝衰竭患者予以恩替卡韦治疗并随访12个月，通过抑制HBV复制，可导致Th17类细胞比例升高，伴有Treg比例的下降，但文章作者认为这种改变对疾病的影响目前还不清楚。
一项在恩替卡韦治疗CHB患者48周的研究中，检测患者外周血中免疫细胞的频数。Th1和Th17类细胞的频数在第4周时显著升高(t=2.386、2.998，p<0.05)，之后逐渐下降至接近治疗前，48周时仍高于正常对照组；Th2类细胞频数在治疗4周后显著高于治疗前(t=3.062，p<0.05)，12周达到峰值，在48周时低于正常对照组(t=2.690，p<0.05)；调节性T淋巴细胞频数下降至接近健康水平，提示恩替卡韦抑制病毒复制，降低炎症反应，可能也削弱机体清除病毒的能力。(https://www.daowen.com)
总之，乙型肝炎发生重症化时，宿主免疫应答发生较大的变化，对肝衰竭的发生和发展起重要作用。其中炎性细胞因子的级联激活，导致免疫功能低下是较重要的免疫应答表现。机体内各种炎性细胞因子对免疫应答往往起到正反馈作用，但是过多的炎性细胞因子也会对机体造成损伤。有研究发现，慢加急性肝衰竭患者、败血症患者与稳定的肝硬化患者相比，TNF-α分泌减少，HLA-DR表达水平明显下调，IL-6、IL-10分泌增加。此外，还有许多研究者分析了肝衰竭时TNF-α、IL-1、IL-10、IL-6的表达水平，鉴于其与疾病的相关性，一些研究者建议，细胞因子的水平可以作为评价预后及预测生存率的指标。目前，越来越多的研究结果支持抗病毒治疗除具有抗病毒的直接作用外，还有助于重塑机体的免疫应答。从上述研究可以发现，抗病毒治疗后Th1/Th2类细胞因子水平升高，免疫功能改善并重建，随着治疗时间的延长，炎症得以减轻，因此抗病毒治疗对治疗和预防乙型肝炎重症化有重要作用。
四、抗病毒治疗对HBV相关肝衰竭的疗效与肝病进展
1.抗病毒治疗对HBV相关肝衰竭的疗效
HBV相关肝衰竭患者作为一类特殊人群，在选择抗病毒药物种类时应谨慎，干扰素有一定的副作用，而且会由于免疫反应增强而加重肝坏死，在肝衰竭时应禁用。随着口服抗病毒药物的不断发展，以及近十年来在抗病毒治疗中积累的大量循证医学证据和临床实践经验证明，HBV相关肝衰竭患者应用拉米夫定(LAM)、阿德福韦(ADV)、替比夫定(LDT)和恩替卡韦(ETV)等抗病毒药物进行治疗已成为必不可少的一项治疗措施。
LAM能够快速抑制HBV逆转录酶活性而发挥高效抗病毒作用，降低HBV DNA载量，减轻肝脏炎症，促进肝功能恢复，使患者获得病毒学、肝组织学和肝脏生化功能的改善。LAM具有疗效快、口服方便、安全性高等优点，是最早应用于肝衰竭患者的抗病毒药物。有文献报道单独使用LAM治疗并不能阻止病情的继续恶化，但联合LAM和其他保肝类药物治疗对慢性肝衰竭患者的远期恢复肯定是有益的。对于急性肝衰竭，研究显示LAM有很好的疗效，不仅可以增加患者的生存率，还可以促进HBsAg的清除和血清学转换。从实验结果看，早期应用LAM进行抗病毒治疗效果更好，可以缩短住院时间，促进肝功能的恢复。
ETV是环氧羟碳脱氧鸟苷类似物，通过竞争性抑制HBV DNA聚合酶及参与HBV DNA链合成过程以终止新链合成，从而迅速且显著地抑制HBV DNA复制，使HBV DNA浓度下降，肝脏炎症减轻，促进肝功能恢复，改善肝组织学。数项大规模、多中心临床试验显示，ETV对HBeAg阳性、初治的HBeAg阴性和LAM治疗失效的肝衰竭患者均显示出快速、有效的抗病毒疗效。对于慢加急性肝衰竭，国内研究者分析了132例HBeAg阴性和51例HBeAg阳性患者短期使用ETV的疗效，结果提示短期内抑制HBV DNA的复制并不能阻止肝衰竭患者的病情进展。
近期的研究发现，LDT治疗乙型肝炎肝硬化失代偿期患者2年，可以较好地控制病毒复制、改善肝功能，提高这些患者的生存率，而且其不良反应事件的发生率与LAM类似。LDT用于治疗乙型重型肝炎的病例报道尚不多，在治疗乙型重型肝炎疗效得到初步证实之时，还发现部分病例出现肝功能波动、肌酸激酶(CK)升高等不良反应，故其远期安全性及有效性尚待进一步研究。
ADV抗病毒活性较低且起效慢，因此较少应用ADV治疗急性和亚急性肝衰竭。如今在抗病毒治疗优化时代，对于这种特殊人群，LAM和ADV的初始联合是否对这类人群的远期效果产生更多的益处，包括对病毒的持续抑制、肝功能的控制和稳定、疾病并发症的发生、提高远期生存率和减少耐药等，已成为临床医师关注的一个方向。ADV对HBV野生型和LAM诱导病毒变异株均有明显的抑制作用，因此对由LAM耐药病毒变异株引起的肝衰竭早期加用ADV，能减缓或终止病情恶化，降低病死率。ADV由于与其他核苷(酸)类似物没有交叉耐药位点，临床上常被作为其他核苷(酸)类似物(如LAM、ETV和LDT)耐药导致肝衰竭的挽救治疗的首选药物。
替诺福韦口服吸收后磷酸化为有活性的替诺福韦二磷酸盐，替诺福韦二磷酸盐通过渗入新生的DNA中与脱氧三磷酸腺苷竞争而抑制HBV DNA聚合酶，终止DNA链的延伸，替诺福韦能够抑制HBV及LAM耐药病毒变异株。它主要从肾脏代谢(包括肾小管分泌)，如果患者有明显肾脏损害表现(血清肌酐清除率小于50mL/min)，应调整剂量。目前应用于肝衰竭的治疗未见报道。
2.抗病毒治疗对肝病进展的影响
抗病毒治疗除抑制病毒外，还要争取获得HBeAg及HBsAg的血清学转换，才能更好地改善远期预后。一项来自中国台湾地区的研究表明，干扰素治疗组累积的肝癌发病率比对照组显著降低，生存期明显延长。意大利的一项研究显示，IFN治疗组肝病相关的死亡率明显低于对照组。
另有研究显示，在疾病的早期与晚期分别应用抗病毒治疗，患者的住院好转率及3个月的中位生存时间均存在差异，HBV DNA载量未降低的患者死亡风险显著增加，提示早期抗病毒治疗可以有效遏制重症化过程，降低HBV DNA载量可阻断肝坏死，促进肝组织修复并改善患者的预后。
然而，关于乙型肝炎相关肝衰竭患者的抗病毒治疗问题尚存在争议。影响乙型肝炎相关肝衰竭预后的因素众多，年龄、并发症、血清总胆红素水平、凝血酶原活动度、血肌酐、感染等对预后的影响已得到公认。有研究表明，发病早期应用抗病毒治疗可改善乙型肝炎相关肝衰竭患者的预后，病毒载量的高低与肝衰竭患者的预后及对抗病毒治疗的应答可能有关。而对于晚期患者，抗病毒治疗并不能显著改善患者的临床症状和病死率。
随着抗病毒药物随机对照试验(RCT)结果的不断累积，人们对CHB抗病毒治疗的认识取得了很大进展，美国、欧洲等国家和地区纷纷出台了各自的抗病毒治疗指南。目前抗病毒治疗的适应证范围在不断扩大。各种指南对乙型肝炎肝硬化肝功能失代偿的慢性肝衰竭患者主张尽早进行抗病毒治疗；发生乙型肝炎相关肝衰竭而等待肝移植的患者，当HBV DNA阳性时，也应接受核苷(酸)类似物治疗。
近年来的临床实践证明，抗病毒治疗对防治乙型肝炎的疾病进展有着不可或缺的重要作用。
3.当前研究存在的问题
乙型肝炎的重症化存在多种临床表现：①原本相对免疫耐受者突然出现ALT水平极度升高、黄疸，并在短时间内出现肝功能失代偿；②长时间反复轻、中度肝功能异常，病毒载量持续不降，缓慢进展为肝硬化失代偿；③患者感觉无症状，持续监测转氨酶几乎正常，但肝组织学已见严重炎性浸润和纤维化，直到出现症状时已发展为失代偿肝病。不同的临床进展模式有不同的免疫学背景，同一临床模式在发展的不同阶段免疫学表现也有差异。迄今为止，并无国际公认的定义涵盖乙型肝炎重症化的各种进程，各研究均自行定义“慢加急性肝衰竭”“慢性乙型肝炎急加重”“暴发性肝炎”等，对研究结果的解释需要谨慎对待。
CHB急性活动导致的重型肝炎与持续轻度肝功能异常并进展至肝硬化失代偿的免疫发病机制完全不同，前者发病机制类似于脓毒血症，涉及全身性炎症反应，而后者主要是由于病毒抑制免疫系统，免疫系统无法有效清除病毒而造成持续肝功能损害。
乙型肝炎重症化是一个动态的进程，绝大多数研究选取了横断面标本，仅描述了重症化期间免疫系统出现的各种异常，而这些异常与重症化因果关系不明，对于患者如何从病程前期进展到重症化、如何寻找免疫诱发因素仍没有给出合理解释。干扰素和核苷(酸)类似物治疗可阻止CHB患者发展至重症化，对已进入重症化的患者，核苷(酸)类似物不能改善短期(3~6个月)预后，甚至可能增加死亡率，但改善长期预后的价值已明确。对于已出现肝功能异常的患者，由于伦理关系，不可能让患者在未进行抗病毒治疗的条件下长期随访。今后需要更多关注原本处于免疫耐受状态、骤然发生严重肝损害的患者，以及核苷(酸)类似物治疗对此类患者免疫系统的调节作用。
4.展望
乙型肝炎重症化是一个动态的过程，迄今尚无国际公认的定义涵盖乙型肝炎重症化的全部进程，而公认免疫损伤是乙型肝炎发病与重症化转归的重要机制。
抗病毒治疗使病毒载量下降的同时，机体的免疫功能也有所修复。在天然免疫方面，核苷(酸)类似物和干扰素治疗均有改善DC功能的作用，可促进其分泌具有抗病毒作用的炎症因子，或者通过活化T淋巴细胞，以非溶细胞性方式进一步抑制病毒。同时，抗病毒治疗也减少了NK/NKT淋巴细胞引起的肝损害。在适应性免疫方面，疾病早期进行抗病毒治疗可中止过强的细胞免疫和体液免疫反应。干扰素治疗或可自发地引起特异性CTL活性增强而达到清除病毒的目的。核苷(酸)类似物可增强CHB患者HBV特异性的细胞免疫应答。抗病毒治疗还有助于重塑机体的免疫应答，促使Th1/Th2类细胞因子水平升高，机体免疫功能改善并重建。但要最终达到清除cccDNA的目的，唯有修复和提高机体的天然免疫应答和适应性免疫应答，特别是特异性CTL功能，特异性地破坏HBV感染细胞，使残留于肝细胞内的HBV cccDNA降解，并在抗病毒和抗炎保肝治疗基础上联合有效的免疫调节治疗，帮助患者产生HBeAg和HBsAg血清学转换，以充分修复患者的抗病毒免疫应答。只有通过这种广义的抗病毒综合治疗，才能达到根治HBV感染的目的。
鉴于免疫应答在HBV感染控制中的重要作用，抗HBV治疗的突破性进展还有赖于免疫干预手段的不断发展。今后，对机体免疫损伤进行修复和控制，加强免疫介导的病毒清除，将成为乙型肝炎治疗及防止其向重症发展的有力手段之一。深入阐明乙型肝炎患者重症化过程中细胞免疫和体液免疫的变化及抗病毒治疗对机体免疫系统产生的深远影响，将更好地指导临床医师，制订合理的治疗方案，从而阻止乙型肝炎相关的疾病进展，最终达到防止其重症化和改善预后的治疗目标。
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