乙型肝炎重症化早期监控体系的探索
陈智
一、乙型肝炎重症化的诊断现状
肝衰竭是多种因素引起的肝细胞大块、亚大块坏死或严重损害，导致肝脏合成、解毒、排泄和生物转化等功能发生严重障碍或失代偿，出现以黄疸、凝血功能障碍、肝肾综合征、肝性脑病和腹水等为主要表现的一组严重临床症候群。
当前关于肝衰竭的诊断标准国内外学术界存在分歧。首先是肝衰竭的命名和分型方法，各国对其临床诊断的命名标准尚未完全统一。我国既往将肝衰竭诊断为重型肝炎，而欧美国家通常将这类由病毒导致的急性肝衰竭称为暴发性肝炎。亚太肝脏研究学会则根据患者是否存在肝性脑病将肝衰竭分为剧症肝炎和重症肝炎，其中的剧症肝炎相当于欧美国家的暴发性肝炎。国内与国外分类标准的主要分歧在于国内将重型肝炎的概念扩展到非肝性脑病患者，而欧美国家和日本等将肝性脑病Ⅱ期以上作为重型肝炎诊断的必要条件，因为大量研究证实肝性脑病组生存率明显低于非肝性脑病组。不同的诊断标准各有优缺点：将非肝性脑病患者纳入重型肝炎有利于肝衰竭的早期预警和治疗，但是对患者的疗效和预后而言，两组患者存在非常显著的差异，将其分开对待更有意义。对于急性、亚急性和慢性肝衰竭，我国学者强调过去有无肝病史(包括HBV携带史)，而欧美国家则看重本次发作的急性进程，HBV携带者只要过去无明显的肝炎发作史，或仅一过性显性发作，本次发病起病急剧，即列入急性肝衰竭范畴。尽管国际学术界对肝衰竭的诊断标准还存在众多分歧，总体趋势已经逐步走向一致，主要体现在以下几个方面：目前肝衰竭的分类逐步统一，主要分为急性肝衰竭、亚急性肝衰竭、慢加急性肝衰竭、慢性肝衰竭；临床诊断手段以临床指标和病理生理特征相结合的方法为主。关于是否将肝性脑病作为诊断肝衰竭的条件，目前认为它是急性肝衰竭的必需条件，但慢性肝衰竭则不一定会发生肝性脑病，主要表现为肝功能失代偿。肝衰竭患者病情危重，易发生肝性脑病、肝肾综合征和腹水等多种难治并发症，合并多器官功能衰竭，预后极差，内科综合治疗病死率高达50%~90%，仍是世界性难题。多年来，各国学者对肝衰竭的定义、诱因、分类、诊断、治疗等进行了探索，并将一些比较成熟的内容以指南的形式发布。美国和欧洲从2005年至2017年都有相应学会推出指南，这些指南以急性肝衰竭为主要内容。我国于2006年10月发布了第一部有关肝衰竭的指南，即由中华医学会感染病学分会和中华医学会肝病学分会组织撰写的《肝衰竭诊疗指南》。亚太肝脏研究学会发布的专家共识与中国指南内容相近，以肝衰竭为主要内容。2018年我国再次对《肝衰竭诊疗指南》进行了更新，制订了《肝衰竭诊治指南(2018年版)》，借鉴国内外经验，力求反映当前学术界在肝衰竭领域研究的新进展和最新共识。该指南根据病情进展速度和病理组织学特征把肝衰竭分为4类：急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)、亚急性肝衰竭(subacute liver failure，SALF)、慢加急性(慢加亚急性)肝衰竭(acute-on-chronic liver failure，ACLF)和慢性肝衰竭(chronic liver failure，CLF)。急性肝衰竭的特征是起病急骤，发病2周内出现Ⅱ期以上肝性脑病；亚急性肝衰竭起病较急，发病2周至26周内出现肝功能衰竭的临床表现；慢加急性肝衰竭在慢性肝病基础上出现急性肝功能失代偿和肝功能衰竭的临床表现；慢性肝衰竭是在肝硬化基础上，缓慢出现肝功能进行性减退导致的以反复腹水和(或)肝性脑病等为主要表现的慢性肝功能失代偿。在病理诊断上主要表现如下：①急性肝衰竭：肝细胞呈一次性坏死，可呈大块或亚大块坏死，或桥接坏死，伴存活肝细胞严重变性，肝窦网状支架塌陷或部分塌陷。②亚急性肝衰竭：肝组织呈新旧不等的亚大块坏死或桥接坏死；较陈旧的坏死区网状纤维塌陷，或有胶原纤维沉积；残留肝细胞有程度不等的再生，并可见细、小胆管增生和胆汁淤积。③慢加急性(慢加亚急性)肝衰竭：在慢性肝病病理损害的基础上，发生新的程度不等的肝细胞坏死性病变。④慢性肝衰竭：弥漫性肝脏纤维化以及异常增生结节形成，可伴有分布不均的肝细胞坏死。该指南所定义的慢加急性肝衰竭，与国外的ACLF的概念并不完全一致，它强调慢加急性肝衰竭是在慢性肝病的基础上急性发作而出现的肝衰竭，这里的慢性肝病指的是慢性肝炎和代偿良好的肝硬化，而欧美国家所指的ACLF更注重在较明确肝硬化基础上发生的急性肝衰竭，而在慢性肝炎或静止性肝硬化基础上发生的急性肝功能的失代偿归入急性肝衰竭。
目前各国对肝衰竭的诊断标准差异主要围绕在慢加急性肝衰竭的定义上，基于COSSH多中心大样本研究，我国《肝衰竭诊治指南(2018年版)》对慢加急性肝衰竭的诊断标准进一步细化：在慢性肝病基础上，由各种诱因引起以急性黄疸加深、凝血功能障碍为肝衰竭表型的综合征，可合并包括肝性脑病、腹水、电解质紊乱、感染、肝肾综合征、肝肺综合征等并发症，以及肝外器官衰竭。短期内发生急性或亚急性肝功能失代偿的临床症候群。其主要表现如下：①患者黄疸迅速加深，血清总胆红素不低于正常上限值的10倍或每日上升17.1μmol/L，极度乏力，有明显的消化道症状；②黄疸迅速加深，血清总胆红素大于正常上限值的10倍或每日上升量大于等于17.1μmol/L；③有出血倾向表现，PTA≤40％(或INR≥1.5)，并排除其他原因；④失代偿性腹水；⑤伴或不伴肝性脑病。根据不同慢性肝病基础分为3型：A型，在慢性非肝硬化肝病基础上发生的慢加急性肝衰竭；B型，在代偿期肝硬化基础上发生的慢加急性肝衰竭，通常在4周内发生；C型，在失代偿期肝硬化基础上发生的慢加急性肝衰竭。2013年欧洲肝脏研究学会根据2011年欧洲EF-CILF开展的多中心、前瞻性CANONIC研究的结果，对慢加急性肝衰竭的诊断强调的是肝硬化基础上的多器官(肝、脑、肾等)衰竭以及28日的高死亡率(>15%)。美国肝病研究学会对ACLF的定义与欧洲类似。由于东西方国家肝衰竭患者的病因不同、慢性肝病基础不同、发病诱因不同等，患者的临床特征存在较大差异，对我国而言，开展具有本国特色的多中心大样本研究，弥补西方国家对肝衰竭诊断的空缺，同时采用多组学技术阐明乙型肝炎重症化的分子特征及发生发展机制，建立早期诊断及预警预测的精准检验具有重要意义。
二、乙型肝炎重症化早期监控体系的构建设想
HBV感染是我国较常见的病毒感染性疾病之一。根据临床表现的不同，HBV感染可分为多种类型：无症状携带状态、急性自限性肝炎、慢性肝炎、重型肝炎(FH)。母婴传播是HBV的重要传播途径，患者慢性感染后通常处于免疫耐受状态，对HBV不发生应答，但是往往有相当一部分慢性肝炎患者在一定条件下出现重症化转变。乙型重型肝炎起病急，发展迅速，短期内即出现肝组织大块或亚大块坏死。目前临床上缺乏特异、有效的治疗方法，除非实施紧急肝移植，否则大部分患者预后不佳。目前学者们公认，乙型肝炎重症化的发生与发展受病毒和宿主两个方面因素的影响，其具体作用机制尚未明了，且临床上缺乏敏感、有效的监控体系。深入揭示乙型肝炎重症化发生的具体机制，综合考虑患者的临床表现、实验室检查结果、HBV基因型及病毒变异、宿主免疫状态及遗传背景等各个因素，筛选出乙型肝炎重症化进程的早期预警和监测指标，通过生物信息学技术分析各因素的权重，建立起一套切实、有效的早期监控体系，将有助于有针对性地进行早期干预、早期治疗，提高疗效，降低乙型重型肝炎的发病率和病死率。
(一)对乙型肝炎进展过程中的临床病程和实验室检查指标的监测是乙型重型肝炎早期监控体系的重要组成部分
临床上，很多乙型重型肝炎患者在出现典型的实验室检查指标改变之前，表现出来的一些临床症状已提示乙型肝炎发生重症化转变。尽管单项指标的指示意义有限，但对多项指标的联合监测则可使早期诊断的敏感性和特异性显著提高。乏力加重、食欲减退加重、出现恶心呕吐甚至持续恶心呕吐、腹胀加重，这是由肝脏不能灭活内毒素，引起内毒素血症，从而刺激膈神经或迷走神经所致。黄疸在短期内迅速加深，血清总胆红素每日升高大于等于17.1μmol/L或黄疸持续时间较长，或黄疸出现后其他自觉症状加重，以及有出血倾向，PTA≤40%或全身可见出血点或瘀斑等，提示可能有重型肝炎发生。另外，肝臭、轻度神志异常也是重要的提示症状。
(二)对乙型重型肝炎的病毒学、遗传学、免疫学等方面特征的深入研究为乙型肝炎重症化早期监测体系的建立奠定了基础
1.HBV变异与乙型肝炎重症化的关系
HBV变异与感染者的临床表现有关，且某些HBV变异与重型肝炎的发生直接相关。深入研究HBV变异株产生的机制、HBV变异株在转录复制和生物学表型上的特性，可为深入研究乙型肝炎重症化的发病机制提供可能的切入点，并为寻找早期监测乙型肝炎重症化发生与发展的标志物提供线索。
HBV的聚合酶缺乏校正功能，在复制的过程中产生大量的核苷酸错配，在体内出现大量基因序列不同而在遗传学上密切相关的突变体，也就是说HBV在体内是以准种的形式存在的。最常发生的突变位于前核心和核心启动子区域，该区域突变导致HBeAg表达减少甚至不能合成，但患者仍存在病毒血症并可发展为进行性肝病。核心启动子区域的突变与肝细胞癌风险增加有关。在抗病毒药物的压力之下，耐药变异株被选择出来而成为优势株，HBV聚合酶相关的突变赋予HBV对核苷和核苷酸类抗病毒药物的耐药性是乙型肝炎治疗失败的主要原因。抗病毒药物的耐药突变可导致肝炎加重甚至重型肝炎。HBV前S区及S区突变可以促进病毒逃避宿主免疫，是接受HBV疫苗或乙型肝炎免疫球蛋白免疫预防治疗失败的主要原因，也与肝炎的暴发或进展、肝硬化和肝癌的发生有关。
前核心区(PC区)的G1896A突变导入了一个终止密码，使HBeAg合成提前终止。由于HBeAg与HBcAg在T淋巴细胞水平有相同的免疫原性，它的存在可以缓解CTL对感染的肝细胞表面的HBcAg的攻击，诱导免疫耐受。而HBeAg合成障碍，机体免疫系统对感染的肝细胞产生强烈的杀伤作用，促使肝细胞大量坏死；基本核心启动子(basal core promoter，BCP)区A1762T/G1764A突变增加了HBV的复制能力，使HBV在肝细胞间迅速蔓延，诱导乙型重型肝炎的发生。日本学者Ozasa等对40例乙型重型肝炎和261例急性自限性乙型肝炎患者的研究显示，乙型重型肝炎患者G1896A和A1762T/G1764A位双联突变的检出率分别为53%和50%，明显高于急性自限性乙型肝炎的9%和17%。体外试验进一步证实Bj型HBV的G1896A和A1762T/G1764A变异株DNA复制水平显著提高。日本学者Nagasaki收集了由同一病毒群(病毒的差异在0~0.3%)引起的5例乙型重型肝炎病例，发现各个病例的HBV中均存在G1896A、A1762T和G1764A突变。徐东平等对793例中国乙型肝炎患者的研究发现，BCP/PC区突变与慢加急性肝衰竭(ACLF)的发生相关，且PC区突变ACLF患者比PC区未突变ACLF患者死亡率更高。
除了上述两个经典突变外，近年来又发现了多个与乙型重型肝炎发病相关的突变位点，主要包括BCP区的1753、1766、1768位点及位于PC区的1899、1862位点。日本学者Sainokami等对急性乙型重型肝炎和急性自限性乙型肝炎患者的分析结果提示，前C区(G1896A/G1899A)/BCP区(T1753A/C、T1754C/G、A1762T/G1764A)同时存在突变，这与乙型重型肝炎的发生相关，并影响乙型重型肝炎患者的预后。单独的G1862T突变降低HBV的复制，而合并了其他特定的突变可以抵消这种抑制作用甚至使HBV复制大大增强，这可能是引起重型肝炎的重要原因之一。
HBcAg是CTL攻击的靶点，C基因突变可引起HBcAg抗原表位和功能区域发生改变，从而影响机体的免疫应答，CTL表位变异可能是影响乙型肝炎重症化进程的一个病毒学因素。HLA-A2限制性HBV特异性CTL表位是目前研究最深入的表位。短肽开头和末尾的两个氨基酸是与HLA-A2分子结合的关键位点，变异很可能会使CTL表位与HLA-A2分子结合的亲和力下降，从而影响抗原呈递，最终影响CTL的应答。短肽其余氨基酸发生变异会改变多肽的空间结构，同样会影响HLA-A2分子与其结合。故推测HBcAg的某些改变可能增强了CTL与抗原的结合能力而导致肝炎加重。近期日本学者Sugiyama等研究发现，从1例乙型重型肝炎患者分离的病毒株除了FH中常见G1896A突变外，还存在A2339G和G2345A变异，位于前蛋白转化酶furin的作用位点。体外试验显示转染了A2339G突变株的肿瘤细胞内全长C蛋白大量累积，HBV高效复制。其HBV复制率与加入了furin抑制剂的野生型HBV相似，推测这一突变通过抑制furin对C蛋白的裂解作用，使C蛋白大量积聚，从而促进HBV复制。
前S1/S2基因为HBV变异最大的区段，最容易出现缺失变异。该区域存在的核苷酸或氨基酸的改变可以使得大蛋白、中蛋白、小蛋白比例失调，影响病毒蛋白分泌或病毒复制。日本学者Chen等对同一感染源的重型肝炎和急性肝炎(AH)病例进行测序发现前核心区和核心启动子区均未见突变，而重型肝炎病例S1区2928、3067、3078位点存在突变，其认为这三个是与FH发病相关的候选位点，它们的具体功能有待进一步明确。对1例母婴传播引起新生儿重型肝炎病例的研究发现，其存在前C区G1896A突变和前S2区起始密码子突变，HBeAg和前S2区合成障碍。体外研究发现变异株病毒复制活性并未增强，因此认为HBeAg和前S2区的缺失与重型肝炎发病相关，而非病毒的复制能力。S基因突变可引起T、B淋巴细胞表位发生改变，影响其免疫原性。美国学者Khan等对S区存在的M133T、G119E、R169P等突变进行研究发现，不同的突变可以上调或下调病毒的分泌功能。对1例接受肝移植并用特异性免疫球蛋白治疗后复发的乙型重型肝炎患者的研究，检出ntG587A突变，导致S蛋白第145位氨基酸由甘氨酸变成了精氨酸，引起表面蛋白在内质网上聚集，体外试验进一步证实其病毒复制能力增强及病毒颗粒分泌障碍，推测可能与乙型重型肝炎的发生机制有关。陈智等在一项关于HBV突变和乙型肝炎重症化的研究中发现了S区2个新的与肝炎加剧相关的突变位点ntT216C、ntG285A，且这两个位点的出现与HBV的基因型密切相关。在B型CHB患者中，随着病变逐步加重，这两个位点的突变频率均显著提升；而在C型CHB患者中，未见这一现象。这是新发现的一种与暴发性肝炎发病相关的HBV基因突变模式，进一步的研究可为乙型肝炎重症化的早期预测提供帮助。
日本学者Ohkawa等人跟踪随访一批慢性HBV感染发展为暴发性肝炎的患者，对两个发病阶段的血清HBV特征进行分析。体外试验显示无论是慢性期还是乙型重型肝炎期的HBV，其体外复制率均显著高于野生型的HBV。慢性期的HBV缺乏合成松弛环状HBV DNA和释放含有松弛环状HBV DNA的病毒颗粒的能力，而乙型重型肝炎期HBV具备这种能力。研究表明，在慢性期的HBV中前S/S基因存在很多突变和缺失，而在乙型重型肝炎患者中未见这种变异。而这些变异与病毒株合成和释放松弛环状HBV DNA能力的丧失关系密切。而且慢性期HBV的能力缺失状态可以通过转入野生型的HBV前S/S蛋白而逆转。因而他们认为HBV由超突变的状态逆转为未突变状态后重新获得了合成和分泌松弛环状HBV DNA的能力，故患者病情恶化。
P基因是逆转录酶(reverse transcriptase，RT)的编码基因，与病毒复制密切相关，已知与耐药基因相关的位点均位于P基因的RT区，且P区和S基因是重叠的，P基因的突变通常伴随S蛋白抗原性和CTL表位的改变，而S基因的突变也可以引起RT功能的改变。P区最常见的突变为拉米夫定耐药突变，即YMDD(rtM204V/I)模序突变，拉米夫定耐药后不合理停药可导致野生型HBV急剧诱发重型肝炎，同时人们发现YMDD模序突变可以降低HBsAg的抗原性。对1例拉米夫定和泛昔洛韦耐药的继发乙型重型肝炎患者的研究发现，治疗之前患者体内的准种HBV各基因片段突变呈多样化，当发生重型肝炎时存在独特的突变：BCP区(A1762T、G1764A)，P蛋白(rtL180M、rtM204V、rtA222T，rtL336V)、C蛋白(cP5T、cS26A、cV85I、cP135A)、S基因(sI195M、sM213I)和X蛋白(xK95Q、xN118T、xK130M、xV131I)，因而有必要对耐药CHB患者的这些突变进行检测，以预测重型肝炎的发生。
HBV变异与乙型重型肝炎的发病关系的具体机制仍需进一步研究，但可以肯定的是，HBV变异是乙型重型肝炎发病的重要诱因之一。HBV存在不同的基因型，对相同的变异有不同的反应，这增加了研究的难度，使得乙型重型肝炎的发病机制研究障碍重重。人们需要通过对病例进行大规模筛查，获得与乙型重型肝炎发生明确相关的突变位点及基因型，为乙型重型肝炎的预警提供依据。同时对特定变异位点进行体外研究，排除干扰因素，确定其具体的功能。
2.宿主的遗传因素、免疫应答反应与乙型肝炎重症化进程关系密切
有相当多的证据显示宿主遗传背景在乙型肝炎重症化过程中的重要性：同样是数十年病史的CHB患者，存在多种不同的疾病表型，仅一小部分患者会发生乙型重型肝炎；不同的人种发生乙型重型肝炎的比例存在显著差异(亚洲人显著高于欧洲人、美洲人)；相同的基因型及相同的HBV基因突变模式既可见于无症状携带者，也可见于乙型重型肝炎患者。因此笔者认为，乙型肝炎重症化的遗传特征具有疾病异质性、遗传异质性和变异位点作用效能差异等复杂性。目前，对HBV感染与清除、慢性HBV感染引起的肝硬化及肝癌等疾病表型的遗传因素研究较多，但对乙型重型肝炎遗传易感性研究较少。目前关于乙型重型肝炎和宿主遗传因素的研究几乎全部来自亚洲人群，大部分采用的是候选基因-疾病关联研究策略，主要涉及乙型肝炎免疫反应通路的几个基因，如TNF-α、TNF-β、IL-10、IP-10、维生素D受体、HLA等。人们对这些基因多态性与乙型肝炎严重程度的关系开展了分析研究，发现其与乙型重型肝炎的发生密切相关。王宇明等对Th1型免疫反应通路上的IP-10基因进行了SNP检测，发现IP-10基因的多态性主要集中于启动子区。疾病关联研究证实了IP-10基因启动子区-1596T-201A单倍型增加HBV慢性感染加重的风险，进一步的功能实验显示G-201A是一个rSNP位点，提示IP-10蛋白参与乙型肝炎患者肝组织的炎症和坏死过程。基于全基因组策略的遗传关联研究，与候选基因策略相比，其优点在于统计效能极大提高，同时可以避免群体分层偏倚和基因选择的偶然性，可以从全基因组角度获得复杂疾病遗传特征的全局、系统的认识。美国学者对HBV cccDNA微小染色体翻译后修饰(post-translational modifications，PTMs)绘制的全基因组图谱显示，转录激活的PTMs水平决定了cccDNA的活性。HBx与DNA损伤结合蛋白1结合并招募cullin 4A-RINGE3泛素连接酶(CRL4)形成CRL4-DDB1复合物，该复合物泛素化Smc5/6复合物并通过蛋白酶体将其降解以激活cccDNA转录。该结果提示，Smc5/6复合物在HBx缺失的情况下通过组蛋白PTMs在表观遗传学上沉默cccDNA。对cccDNA的表观遗传学研究，阐明其机制，有助于后续靶向cccDNA药物的研发。我国学者通过开展HBV感染相关的全基因组关联研究(genome-wide association study，GWAS)，对其临床特征及肝炎重症化等进行了分析，具体参见下文。
乙型肝炎重症化常出现在宿主免疫状况变化后，乙型肝炎重症化很可能是宿主打破了慢性感染免疫耐受状态，同时发生了新的更强烈的免疫应答。发生乙型肝炎重症化时，最突出的免疫应答表现为炎症因子的级联激活，导致“类败血症”的免疫瘫痪。肝脏内及系统的炎症因子对免疫应答起正反馈作用，但是过多的细胞因子会对机体造成损害。近年来多项研究表明，暴发性肝衰竭患者中存在细胞因子表达的严重失衡。IFN-γ和TNF-α是两类在乙型重型肝炎发病过程中大量分泌的促炎性细胞因子。德国学者Streetz等研究了暴发性肝衰竭患者中的TNF-α和TNF受体(TNF receptor，TNFR)表达情况，结果显示，TNF-α/TNFR系统在暴发性肝衰竭(FHF)患者中过度表达。Ohta等报道IFN-γ受体缺失的小鼠模型对导入HBsAg特异的Th1细胞耐受，也证实了IFN-γ是乙型重型肝炎发病不可缺少的因素。对乙型重型肝炎患者肝内细胞因子表达的研究结果显示，慢性乙型重型肝炎组IFN-γ水平显著高于CHB组和正常对照组，进一步证实了上述观点。而IL-10起抗炎作用。它们的数量对免疫反应的平衡起着重要的直接作用。德国学者Leifeld等报道在重型乙型肝炎(FHB)患者中细胞因子IL-12、IFN-γ和IL-10在肝内表达不平衡。国内学者Zou等对ACLF患者肝内IFN-γ、TNF-α和IL-10表达情况进行了研究，研究结果显示肝内促炎性细胞因子IFN-γ、TNF-α在ACLF组中显著高于CHB组和正常对照组，而抗炎因子IL-10在3组间未见明显差异。这表明肝内细胞因子表达失调可能在ACLF患者肝脏的严重损伤中起重要作用，同时也提示在CHB患者的免疫网络未被完全激活前就可能导致ACLF的发生，这为ACLF的早期预警和治疗提供了帮助。
生物芯片技术具有在全基因组水平同时探查生命过程中成千上万个转录物丰度的能力，正被越来越广泛地应用于对复杂生物学过程的洞察。国内学者谭文婷等人开展HBV-ACLF表型的全基因组关联研究(GWAS)，在建立HBV-ACLF病例大样本、多中心队列的基础上，对其临床特征及炎症因子谱进行了分析，并对主要关联位点HLA-DR进行了精细解析和功能注释，以及阳性关联HLA等位对HBV变异的限制性分析。主要研究结果显示：HBV-ACLF中有肝硬化基础及无肝硬化基础的两种亚型的共同遗传关联位点位于6号染色体HLA-Ⅱ区域，其中HLA-DR区域是主要关联位点。分层分析显示rs3129859是HBV-ACLF的独立风险因素，与慢性乙型肝炎活动状态和HBV再活化无关。风险等位rs3129859*C与HBV-ACLF临床进程相关。HLA-DRB1*1202等位是HBV-ACLF最显著的风险等位，HLA-DRB1*1202的全球分布与HBV-ACLF地理流行病学趋势一致，在中国和东南亚地区等位频率最高。等位单倍型rs3129859C-DRB1*1202-DQA1*0601-DQB1*0301和氨基酸单倍型DRβ-LEHHLLA-DQα-GCVLQdel TL-DQβ-E是风险单倍型，携带风险单倍型的HBV感染者，罹患ACLF的风险更高。另外随着GWAS的兴起，研究人员基于该策略在亚洲人群中陆续发现了数个新的与HBV 感染慢性化相关的遗传易感基因区域，包括HLA-DP(rs3077 和rs9277535)、HLA-DQ(rs2856718 和rs7453920)、HLA-C(rs3130542)、EHMT2(rs652888)、TCF19(rs1419881)、CFB(rs12614)、UBE2-L3(rs4821116)、CD40(rs1883832)和INTS10(rs7000921)等。国内李君课题组通过建立HBV-ACLF患者mRNA、miRNA和蛋白三组学全匹配数据库，从mRNA水平系统揭示了HBV-ACLF发病及转归的分子机制。该研究从COSSH-ACLF样本库中随机选取包括HBV-ACLF共360例样本进行转录组分析。结果显示，肝硬化基础ACLF和非肝硬化基础ACLF患者的总体mRNA表达无明显差异，而ACLF组患者与慢加急性肝衰竭、肝硬化、慢性乙型肝炎和健康对照组存在显著差异。通过差异表达结合功能分析的方法发现免疫、代谢、凝血、炎症、凋亡、肾功能损害、损伤修复等生物学功能与ACLF的发生、发展密切相关，首次揭示HBV激活引起的免疫代谢失衡导致的多器官功能衰竭是HBV-ACLF发病的关键机制，不同于欧洲CLIF-ACLF的系统性炎症反应假说机制，为建立新的治疗方法、降低 HBV-ACLF高病死率提供理论依据。另外，国内陈智课题组收集重型肝炎动物模型和不同病程、不同病情乙型重型肝炎患者的肝组织、血液、尿液标本，通过基因组学、蛋白质组学、代谢组学等技术动态研究乙型肝炎重症化过程中不同时间点的基因表达、miRNA、蛋白质及代谢小分子的变化特征。鉴定出全基因组范围内乙型重型肝炎发病相关的宿主因素，为阐明乙型重型肝炎的发生、发展机制提供了新思路，为临床乙型重型肝炎的早期监控和治疗提供新的靶标。同时该课题组利用我国有大量病毒性肝炎病例样本的优势，收集2426例HBV携带者、CHB(轻度、中度、重度)患者、肝衰竭患者血清，针对上述系统生物学方法筛选出来的部分指标进行临床验证，其中Tim-3、iNOS、MIP2、NGAL四个指标能明确区分肝衰竭组与其他组患者，可用于监测CHB患者病情，对指导临床治疗具有较要的意义。后续研究发现，HBV-ACLF患者的外周血IL-33/ST2、PGE2的表达水平相较CHB患者有显著变化，对疾病病情评估、预后等有提示意义。另外课题组发现骨髓间充质干细胞来源外泌体可以通过 miR-17抑制巨噬细胞NLRP3炎症小体来缓解急性肝衰竭小鼠的肝损伤，为后续制备治疗急性肝衰竭的药物提供新思路。
机体的NK细胞、NKT淋巴细胞、单核-巨噬细胞系统、T淋巴细胞、B淋巴细胞、内皮细胞及凝血系统等因素均可能影响肝衰竭的进程及预后。Zou等发现乙型重型肝炎患者NK细胞在肝脏内富集，免疫组化结果显示其显著高于正常人、轻度慢性乙型肝炎和肝硬化患者，而乙型重型肝炎患者外周血NK细胞数则比其他组都低，说明NK细胞与乙型肝炎重症化有着紧密的联系。Vilarinho等在小鼠重型肝炎模型中封闭NKT淋巴细胞上的NKG2D，成功阻止了该细胞介导的急性肝炎和肝损伤，为重型肝炎的治疗提供了潜在靶点。在乙型肝炎重症化进程中单核-巨噬细胞系统能够产生大量细胞因子，上调HLA-DR及Toll样受体的表达进而激发机体的适应性免疫。国内李君课题组发现HBV-ACLF患者外周血的MIP3α含量较CHB患者明显上升，与HBV-ACLF患者3个月死亡率具有明显相关性，可用于判断预后，提示疾病严重程度。酪氨酸蛋白激酶Mer(tyrosine-protein kinase Mer，MerTK)是免疫细胞表面的负调控分子。英国学者Triantafyllou 等发现急性肝衰竭患者的循环和组织中MerTK+HLA-DRhigh单核细胞显著扩增，后续动物实验表明，急性肝衰竭中MerTK+肝巨噬细胞增加促进肝脏炎症的消除。PD-1 是一种重要的免疫抑制分子，是常见的免疫检查点靶标。国内学者发现PD-1 及其配体PD-L1 和PD-L2 在HBV-ACLF 患者肝组织的多种免疫细胞表面高表达，且均高于CHB患者。研究还发现Toll样受体2、Toll样受体4与血浆脂多糖的水平呈正相关，能较好地预测乙型重型肝炎的发展趋势，可用作评价乙型重型肝炎预后的指标。以上研究结果可能为发现重型肝炎疾病预警新指标及免疫治疗的新靶标提供帮助。
三、展望
我国是乙型肝炎患者众多的国家，控制乙型肝炎的发生与发展，尤其是减少或阻止其向重症进展是关乎国计民生的大事，具有极其深远的现实意义。深入研究乙型肝炎重症化的发病机制，构建一套完整的乙型肝炎重症化早期监控体系，为临床监测和防治提供依据，这是目前重大传染病发生与发展研究中的核心和热点问题。近年来，我国在乙型肝炎重症化研究方面已取得很大进步。我国关于乙型肝炎重症化的研究队伍已经具备相当的规模和强大的实力，在病毒感染、变异和复制以及机体遗传特征和宿主免疫反应间的相互作用等基础研究方面有坚实的基础。此外，经过多年的研究累积，我国学者已经建立了多种用于乙型肝炎包括乙型重型肝炎研究的动物和细胞模型，并找到了多个与乙型肝炎重症化相关的HBV基因变异位点、宿主免疫应答标志物和遗传易感基因。同时，国内众多的临床实验室和基础实验室已建立了大规模的乙型肝炎(包括重型肝炎)样本库。我国肝病专家充分发挥国内独特的资源优势，对病毒因素和宿主因素的相互作用，以及它们与肝细胞凋亡和坏死等的关系进行了大量研究，已获得了较大进展。我们目前的重点任务是在充分认识到乙型肝炎重症化过程的复杂性和阶段性的基础上，找到乙型肝炎重症化过程阶段的关键靶点，及早进行干预，以期达到阻断乙型重型肝炎发生的目的。根据现有的研究成果，我们认为要适时地对乙型肝炎患者病毒基因型和基因变异、宿主分子遗传特征、宿主免疫应答三个方面的状态进行评估，一旦发现患者存在相应的高危指标，则立即进行监控或干预。例如，当乙型肝炎患者HBV DNA载量显著升高，同时伴有与乙型肝炎重症化相关的变异发生时，临床医师需要对患者进行密切监测并及时给予适当的干预，防止其向乙型重型肝炎进展，以充分降低乙型肝炎重症化概率。虽然这些年来国内外对乙型肝炎重症化的研究取得了可喜的进步，但是我们也必须认识到目前对乙型肝炎重症化过程的认识还存在较大的局限性。例如，对乙型肝炎重症化机制中的多元调节机制认识不足，大量的研究仅停留在对细胞、分子和个体层次进行孤立研究，未将各层次间的相互作用贯穿起来，因而也就未能充分地认识真正在乙型肝炎重症化过程中实际起作用的要素群。此外，目前国内外发现的乙型肝炎重症化相关细胞模型和动物模型总数相对有限，也在一定程度上限制了乙型肝炎重症化的研究进程，因而开发新的、有代表性的实验模型也是当务之急。
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