乙型肝炎重症化早期预警指标的筛选
陈智 阳乔
一、乙型肝炎重症化早期预警的目的和意义
我国是HBV感染的高流行区，人群中HBsAg流行率为7.18%，HBV携带者约有9300万人，其中约3000万人为慢性感染者。慢性乙型肝炎(CHB)病程迁延，长期发展可演变成肝硬化、肝癌。某些原因可导致其中部分HBV携带者和乙型肝炎患者病情突然加重，随即发展成为急性、亚急性或慢性重型肝炎。在我国由HBV感染所致的重型肝炎患者占重型肝炎患者总数的70％。重型肝炎治疗效果不佳，预后差，病死率高，严重威胁人民群众的生命健康，极大地增加患者家庭和社会的经济负担，影响社会稳定。
目前，尽管针对HBV的抗病毒治疗已取得显著进步，但乙型重型肝炎的发病率仍居高不下。乙型重型肝炎具有起病急、病情复杂、预后差、病死率高等特点，迄今为止，临床上尚缺乏特异性、有效的早期预警和治疗手段，这也是乙型重型肝炎难以预测和病死率高的重要原因之一。目前，对乙型肝炎重症化的自然转归及机制缺乏全面、准确的了解，我国尚未建立针对乙型肝炎重症化的预警、预测和早期诊断的技术和方法，且缺乏能够早期预测乙型肝炎重症化发生、监测病情发展及严重程度的可靠、系统、灵敏、特异的指标和切实可行的评分体系，因而无法实施早期干预，导致患者病情不断加重而错失最佳治疗时机。一旦发展成临床终末期肝病或乙型重型肝炎，救治的机会大为减少，病死率大幅度增高。因此，为了有针对性地早期检测、早期干预、早期治疗，有效地预防乙型重型肝炎的发生，提高乙型重型肝炎的治愈率，降低发病率和病死率，极有必要揭示乙型肝炎重症化的发生规律并阐明其机制，对乙型肝炎重症化早期预警指标进行筛选和研究，并建立乙型肝炎重症化早期预测评分系统。
二、乙型肝炎重症化早期预警指标筛选的主要技术与方法
以生命科学和生物技术为重要代表的新技术革命正在蓬勃兴起和迅猛发展，极大地推动了医学生物技术领域的研究进程。医学生物技术革命和生物信息学的诞生又深刻改变着医学研究的面貌。一方面使人类疾病的机制研究在分子水平上取得进展，另一方面大大推进了探索疾病治疗策略的进程，也为各种疾病早期预警指标的筛选带来了希望。目前已应用于乙型肝炎重症化早期预警指标筛选的主要技术方法如下：基因诊断技术，如聚合酶链反应、基因序列分析、基因芯片、全基因组关联分析等；蛋白质水平上的双向凝胶电泳技术和质谱分析技术；以DNA甲基化和组蛋白修饰为代表的表观遗传学；用于微生物序列和功能分析的生物信息学技术及系统生物学方法。
(一)基因诊断技术
1.聚合酶链反应
聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是一种模拟天然DNA复制过程的体外酶促合成特异性核酸片段技术，以待扩增的两条DNA链为模板，由一对人工合成的寡核苷酸引物引导，通过DNA聚合酶链反应，在体外进行特定的DNA序列扩增。其过程包括变性、退火和延伸，具有操作简单、省时省力、灵敏度高、特异性强、产率高、重复性好等不可替代的特点，是分子生物学研究中应用最广泛的方法，也是基因检测技术上的一次重大革命。PCR理论的提出和技术上的完善对于分子生物学的发展具有不可估量的价值。
目前，运用实时荧光定量PCR可对血清HBV DNA含量进行精确定量，反映HBV感染状态、病毒复制水平及对疗效进行跟踪和对病程进行判断。应用特异TaqMan探针进行实时荧光定量PCR，可以实现对HBV定量、基因分型和位点突变的同步检测，还可以研究HBV DNA含量与其他血清指标间的关系，分析HBV DNA含量与肝损伤程度之间的相关性。运用数字PCR可以实现对样本HBV DNA分子的绝对定量。
虽然PCR技术并不复杂，但若发生实验污染出现假阳性结果，后果将会十分严重。因此，操作应精细和准确，检测环境和操作过程应严格避免污染，并设置阴性对照，这样才能使结果更精确和可靠。
2.基因序列分析
基因序列分析(gene sequence analysis)是一个发展极为迅速的领域，由于DNA的碱基序列蕴藏着丰富的遗传信息，测定和分析DNA的碱基序列对于了解遗传本质及了解每个基因的编码方式是很重要的。目前主要方法包括直接测序法(如DNA链双脱氧末端终止法、化学裂解法、焦磷酸测序法等)、DNA指纹图谱分析、PCR单链构象多态性、PCR夹心法和核酸特定结构分析技术等。目前有学者对HBV基因组的某些特定基因片段进行全碱基序列测定，再结合荧光定量PCR对临床样本进行大规模验证，可以了解病毒基因型、有无突变及突变的类型等，同时筛选出一批与乙型肝炎重症化的发生、发展密切相关的突变位点，这些位点的突变可能引起病毒蛋白关键氨基酸的替换，改变其免疫原性，或者可能影响HBV复制或转录的调节，从而影响肝炎的进程。有必要通过进一步研究来证实这些突变位点与乙型肝炎重症化的关系，监测这些位点将为乙型肝炎重症化的预警、预测和早期诊断提供有价值的信息，为乙型肝炎重症化治疗方案的选择提供依据并预测其疗效，有利于降低乙型重型肝炎的发病率和病死率。
3.基因芯片
基因芯片(gene chip)，也称DNA微阵列或DNA芯片(DNA chip)，是指用微量点样技术或原位合成技术，将大量的DNA探针固定于固相支持物表面，从而产生的二维的DNA探针微阵列。将基因芯片与标记的样品进行杂交，通过荧光扫描仪检测和计算机分析杂交信号来实现对生物样品快速、平行和高效的筛选与分析。其工作原理与经典的核酸分子杂交方法相似，应用已知核酸序列作为探针与互补的靶核苷酸序列杂交，通过随后的信号检测进行定性或定量分析。该技术具有高通量、集成化、微型化和自动化的特点。它是继PCR技术之后生命科学中的又一重大科学技术革命。目前有学者利用基因芯片技术和生物信息学方法研究刀豆蛋白A诱导的小鼠重型肝炎的基因表达谱，探讨肝炎重症化早期相关基因的变化及规律，并经过大规模样本的临床验证，筛选出一批在肝炎重症化早期起实质性作用的关键分子和信号通路，有望用于早期预测乙型肝炎重症化的发生及监测疾病的进展。
4.全基因组关联分析
全基因组关联分析(genome-wide association study，GWAS)是一种用来寻找某种基因变异与表型之间关系的方法。该方法针对某种疾病，对整个种群中全基因组范围内的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)基因进行总体关联分析，寻找某些SNP与疾病表型之间的关系，全面揭示与疾病发生、发展、治疗及预后相关的遗传标记。近期对美国、欧洲和日本的3项独立大样本进行全基因组关联分析，发现编码IL-28B基因附近的rs1297980位点有种族差异性，而且该位点与丙型肝炎自发清除能力及对干扰素治疗应答情况有关。该方法的应用有望帮助人们发现与乙型肝炎重症化易感性相关的遗传靶标，对携带易感性基因的乙型肝炎患者进行风险评估，制订个体化治疗及预防策略，早期预防乙型重型肝炎的发生。
5.元基因组
在微生物群落中，所有微生物基因组的总和称为元基因组。人类是与微生物共生的，人体的生长、发育、免疫、代谢及疾病过程除受自身基因控制外，体内共生微生物的遗传信息及菌群结构也起着重要作用，因此，人体共生微生物的构成可以反映人体的健康状况，除与肠道疾病有关外，还与许多代谢性疾病，甚至是肿瘤的发生有着密切的关系。CHB患者容易发生肠道微生态失衡，肠道免疫屏障功能受损，肠道定植抗力下降，细菌发生移位形成内毒素血症，促进乙型肝炎重症化的发生。在过去的几年里，我国科学家对CHB患者、肝硬化患者肠道微生物的组成及代谢特征进行了详细的研究和分析，明确了在肝病状态下特异的肠道菌群模式，首次发现慢性重型肝炎患者和肝硬化患者存在肠道微生态失调，表现为肠道有益菌如双歧杆菌显著减少，而肠杆菌、链球菌、巴斯德菌等潜在致病菌比例显著增加。肠道微生态失调程度与肝病的严重程度相关，肠道微生态失调与血内毒素水平升高和肝脏损害有关。同时，将患者肠道菌群的变化与肝病的不同阶段进行关联，明确肝病状态下特异的肠道菌群模式，鉴定与肝病状态相关的肠道菌群生物学标志物，发现肠道菌群的变化与病情发展存在显著相关性。以上研究阐明了肠道菌群变化影响肠道免疫屏障、肠道免疫功能变化影响肝病预后的可能机制，为指导临床治疗提供理论依据，并在此基础上研制了肠道生态制剂，这对综合治疗CHB，防止乙型肝炎重症化具有积极的意义。
6.单细胞测序
单细胞测序(single cell sequencing)是对单个细胞进行测序的技术，主要包括单细胞基因组测序、转录组测序和表观遗传学测序，这3种测序类型各具特点和优势，可以从不同角度揭示细胞各个阶段的功能和特性。全基因组测序是对目的细胞的全部基因组序列进行非选择性、均匀扩增，随后利用外显子捕获技术进而使用高通量测序的过程；转录组测序则是获取特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本，尤其适用于具有高度异质性的干细胞及胚胎发育早期的细胞群体的研究；表观遗传学测序可揭示基因调控的不同方面，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质结合结构和调节蛋白、染色体的空间结构与空间相互作用形成转录复合物的组分。与传统的全基因组测序相比，单细胞测序不仅测量基因表达水平更加精确，还能检测到微量的基因表达子或罕见非编码RNA，其优势是全方位和多层次的。根据测序内容可以分为单细胞RNA测序、单细胞全基因组测序、单细胞染色质修饰图谱等多种类型。近期有科学家利用单细胞RNA测序，对来自9名人类供体的1万个细胞进行分析，绘制了健康人体肝脏细胞群的详细图谱，肝脏细胞群包括肝细胞、血管内皮细胞、肝内巨噬细胞和其他免疫细胞类型，以及胆管上皮细胞和肝上皮祖细胞。利用这些数据，能以前所未有的分辨率捕捉细胞类型和细胞状态的多样性，并了解它们在发育过程中或疾病进展过程中是如何变化的，人类肝脏的细胞图谱将是肝病研究的重要参考数据库。单细胞测序技术可用于揭示肝病发展过程中，不同细胞类型之间的相互作用，对发掘乙型肝炎重症化的早期预警指标及新的治疗靶点有重要意义。
7.第三代测序技术
第三代测序技术(TGS)是指单分子测序技术，在测序过程中不需要涉及PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序。第三代测序技术具有超长读长，还拥有不需要模板扩增、运行时间较短、直接检测表观修饰位点等特点。它弥补了第二代测序读长短、受GC含量影响大等局限性，已在小型基因组从头测序和组装中有较多应用。目前已有学者发现TGS在检测HBV全长准种异质性特征方面与“金标准”PCR-克隆测序(clone-based sequencing，CBS)相比具有良好的一致性，并在准种克隆数量和突变检测的数量、敏感性方面均优于CBS。TGS适合研究HBV全长基因组准种构成和特性，并有高通量、高敏感性及低成本的优势。以第三代测序技术为基础的临床相关HBV全长准种特征值得进一步研究。随着基因检测技术水平的提高和实验方法的进一步完善，检测患者HBV全长准种特征将更加方便、快捷并有望标准化，使临床上针对不同准种特征的HBV感染者开展个体化诊疗成为可能。
(二)蛋白质诊断技术
人类基因组计划完成后，蛋白质组学研究理所当然地成为当今生命科学研究领域的热点。从基因组学水平上，无法反映基因转录调节、翻译后修饰、蛋白复合物的形成及蛋白质相互作用等生命现象。蛋白质是最主要的生命活动载体和功能执行者，只有蛋白质才能赋予细胞特定的表型和功能，机体内蛋白质谱不是稳定的，而是随着环境和健康状态变化而改变的。对蛋白质组学的研究更能反映体内蛋白质表达水平、转录和翻译后修饰、蛋白质定位及相互作用等真实情况。
肝脏是人体最大的蛋白质合成、物质代谢及能量转换器官，在人体生命活动中处于枢纽地位，对肝脏蛋白质组学的研究显得尤为重要。HBV感染宿主后，能与受感染宿主成千上万的基因发生相互作用，感染后发病情况远比HBV自身结构要复杂得多。因此，对感染宿主进行蛋白质组学研究，建立乙型肝炎各期、各型的蛋白质组数据库，有助于阐明乙型肝炎的发病机制，为寻找乙型肝炎重症化的诊治靶点提供新思路和新方案。
1.双向凝胶电泳技术
双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis)技术是蛋白质组学研究的核心，其原理如下：利用蛋白质的带电性和相对分子质量大小的差异，第一相进行等电聚焦，蛋白质沿pH梯度分离至各自的等电点；随后，第二相再沿垂直的方向按相对分子质量大小进行有效分离。
2.质谱分析技术
质谱分析(mass spectrometry，MS)技术是蛋白质组学研究中发展较快、较常用的定量策略之一，即用电场和磁场将运动的离子(带电荷的原子、分子或分子碎片)按它们的质荷比分离后进行检测的方法，通过测出离子的准确质量，就可以确定离子的化合物组成。目前应用最多的是双向凝胶电泳联合质谱分析技术，可以实现对蛋白质准确而大规模的鉴定。
有学者将中度和重度CHB患者、急性乙型肝炎(AHB)恢复期患者、乙型肝炎相关肝癌患者的血清蛋白进行双向电泳，通过对双向电泳斑点图的全面分析，以期发现能够用于早期诊断乙型肝炎疾病严重程度的血清学标志物及乙型肝炎发病机制的关键蛋白。通过与AHB恢复期患者组、乙型肝炎相关肝癌患者组血清相比，该研究发现重度CHB患者组血清中有明显改变的差异蛋白质，并对差异蛋白质进行质谱分析和功能鉴定，发现α-抗胰蛋白酶在重度CHB组中表达显著增加。该研究在蛋白质水平研究疾病重症倾向的机制，认为α-抗胰蛋白酶可作为乙型肝炎重症化诊断的血清学标志物，对乙型肝炎重症化的早期预测、早期诊断有重要的应用价值。
(三)表观遗传学研究
人类基因组的遗传信息除了DNA序列本身所储存的信息外，还存在一类在特定时空下调控基因表达的遗传学信息，它提供了如何应用遗传学信息的指令，称为表观遗传学(epigenetics)。表观遗传学修饰主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、RNA沉默、染色质重塑和基因组印迹等，其中DNA甲基化是最常见的表观遗传学改变。
目前，表观遗传学研究已经成为乙型肝炎研究领域的热点，但这方面相关的研究大部分集中在HBV相关的全基因组低甲基化和位点特异性高甲基化与乙型肝炎相关的肝癌发生、发展的关系这两个方面。乙型肝炎相关的表观遗传易感性研究仍很少。近年来，有学者将表观遗传分析与基因芯片技术结合起来，高通量进行全基因组甲基化的定性、定量分析，检测出乙型肝炎患者全基因组范围内的甲基化位点及对基因有调控作用的启动子甲基化位点，通过临床功能分析及细胞、动物模型研究，比较不同炎症程度的肝组织甲基化图谱，筛选出与乙型肝炎重症化及临床预后密切相关的若干关键的甲基化位点。今后应利用我国乙型重型肝炎疾病资源丰富的优势，开展乙型肝炎重症化的全基因组关联研究和全基因组甲基化差异谱研究，完善在不同疾病状态下特定甲基化位点出现及其分布频率的图谱，系统地对甲基化调节机制进行探索，明确甲基化程度、特异性位点对乙型肝炎重症化的影响，开展基于表观遗传学的干预策略，并配合传统的治疗方式，为有效预测、防治乙型重型肝炎发挥积极的作用。
(四)免疫学检测技术
1.流式细胞术
流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段。流式细胞仪集合了光学、流体力学、电子学和计算机技术，借助荧光激活细胞分选器，对细胞做多参数定量测定和综合分析，如细胞大小、表面分子种类等。流式细胞术在研究乙型肝炎重症化的过程中免疫细胞的表型及功能改变方面有广泛的应用。借助流式细胞术可以检测在乙型肝炎病程中执行免疫功能的细胞的表达情况，如单核-巨噬细胞系统、中性粒细胞、NK细胞、NKT淋巴细胞、各亚型T淋巴细胞等，此外流式细胞术还能检测细胞表面一些特异性分子的表达情况，我国科学家通过流式细胞术发现肝硬化失代偿期患者外周血CD14+单核细胞Tim-3表达明显低于肝硬化代偿期和健康对照组，Tim-3+T淋巴细胞的比例与肝脏损伤严重程度呈正相关，而且Tim-3的血清水平与乙型肝炎重症化密切相关。
2.酶联免疫吸附试验
酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是目前应用最广泛的免疫学检测方法。该方法是将二抗标记上酶，利用抗原-抗体反应的特异性与酶催化底物的作用，根据酶作用底物后的颜色变化来判断试验结果，其敏感度可达纳克水平。ELISA的主要方法包括双抗体夹心法、间接法、生物素亲和素ELISA等。ELISA技术可用于检测患者血清中细胞因子的水平。研究发现，可通过ELISA测定血清M30和M65水平，反映肝细胞凋亡水平；ACLF组M30含量高于健康组、低于CHB组，M65含量高于CHB组及健康组，同时ACLF组的M30/M65值最低，且M30/M65值诊断ACLF组患者预后的灵敏度、特异度、ROC曲线下面积均高于MELD评分。以上结果提示M30/M65值可作为HBV-ACLF病情进展及预后评价的指标之一。
3.免疫组化技术
免疫组化技术(immunohistochemistry technique)是利用抗原-抗体反应，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及相对定量的研究技术。免疫组化技术可用于检测肝炎患者肝脏组织特定表型的免疫细胞的数量。我国科学家通过免疫组化技术发现HBV-ACLF患者肝组织中PD-1+、PD-L1+和PD-L2+浸润细胞的数量明显高于CHB或健康对照组，提示这些分子可能有助于开发新的疾病诊断生物标志物或免疫疗法策略。
(五)生物信息学技术
将基因和蛋白质结构的资料与计算机分析技术密切结合起来，形成了极具潜力的新兴交叉学科——生物信息学(bioinformatics)，涉及信息科学、计算机科学、比较生物学等学科。它以计算机和生物电子设备作为工具，整合、加工及分析实验中产生的大量生物信息，用信息理论、技术及生物数学的方法去理解和阐述生物大分子的存在和生物学意义，最终对它们进行各种处理与应用。生物信息学处理的信息主要体现在基因组信息、蛋白质结构模拟和药物设计三个方面，具体内容包括序列对比和分析、基因识别、基因功能和蛋白质结构预测等。在我国，生物信息学方面的研究起步较晚，在乙型肝炎领域的研究仍处于初始阶段，对高通量芯片研究结果的预测也只是初步的，需要进一步验证其预测的结果。分子生物学技术与生物信息学技术相结合，将是当前重大疾病(如乙型肝炎等)发病机制研究的主流方向，这些技术的综合运用，将为探索乙型肝炎重症化早期预测和确定诊治靶点带来新希望。
系统生物学(systems biology)是一种试图整合不同层次的信息，从整体上理解生物系统如何行使功能的研究方法。该方法不只关心个别基因或蛋白质的改变，还将某生物系统整体的细胞信号转导调控、蛋白质表达调控、组织器官的代谢等相互作用网络整合在一起进行研究分析，利用生物信息学等技术，构建整个系统的生物学模型，从不同的视角研究整个生物系统的行为或疾病的发生与发展。未来，系统生物学有望成为研究乙型肝炎重症化的早期诊断和预防的有力武器，通过动态分析乙型肝炎不同病程的基因表达及蛋白质表达的变化特征，结合患者临床表现、实验室检查及整体代谢情况，筛选可预测或早期诊断乙型肝炎重症化的生物学标志物。
三、乙型肝炎重症化早期预警指标的探索及临床意义
(一)实验室检查的早期预警指标
肝脏是人体第一大代谢器官，是物质代谢、能量转换的重要场所。肝功能异常可导致机体多种重要信息调控分子的合成和表达异常，各种化学物质转化代谢的异常，各种血清生化指标也会相应地发生改变。目前已应用于临床的基于实验室检查结果的早期预警指标主要如下：谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)和谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、血清总胆红素、凝血酶原时间(prothrombin time，PT)和凝血酶原活动度(prothrombin activity，PTA)、血清白蛋白与前白蛋白、血清胆碱酯酶和血氨等。各指标在提示疾病严重性方面各有优缺点，临床医师应对患者关键的血清生化指标进行动态监测，从中获取重要的信息，与临床表现、并发症等多方面资料一起进行综合分析，才能准确地判断病情和做出诊断。以上各种指标对乙型肝炎重症化的预警具有重要的提示作用，但由于乙型肝炎重症化病情复杂，变化迅速，仅凭单个指标难以做到准确预测或诊断，为满足临床和社区推广应用的要求，今后，在已建立的技术和方法基础上，很有必要综合临床症状和实验室检查对各种早期预测指标与乙型肝炎重症化发生的风险性进行权重评分，应用多元回归分析，建立乙型肝炎重症化相关的数学模型方程和评分体系，在预警和早期诊断乙型重型肝炎方面取得切实的进步和新的突破。
(二)早期预警潜力指标的探索及临床意义
乙型肝炎重症化的发生与发展机制复杂，造成不同疾病过程和临床结果的原因与以下三个方面因素有关：①环境因素，如暴露人群的综合卫生状况、疫苗接种状况等；②病毒因素，如病毒基因型、病毒变异、病毒载量、感染细胞数等；③宿主因素，除感染者年龄、性别外，还包括遗传易感性、免疫状态、非特异性免疫应答的强度、并发症或重叠感染其他嗜肝病毒等。一般认为，乙型肝炎的进展是一个多步骤、多基因(宿主遗传基因和病毒基因)、多因素(宿主因素、病毒因素和环境因素)相互作用的过程，为了更全面了解乙型肝炎重症化的发病机制，探索乙型肝炎重症化早期预警的潜在指标，近年来科学家们进行了大规模的协作研究，从病毒基因组学、基因转录调控、宿主遗传背景、宿主免疫学应答、宿主代谢组学等多方面研究乙型肝炎重症化发生的可能机制，找出了一系列与乙型肝炎重症化相关的、可早期预示疾病发生、监测疾病发展和严重程度的重要分子靶位，这对建立可靠、系统、灵敏、特异的早期预警指标和制订判断病情、治疗效果及预后的评分体系十分重要，也为降低乙型重型肝炎发病率和病死率提供理论基础。
1.病毒因素
HBV的异质性表现为基因型不同和病毒变异。
1)HBV基因型及亚型
在漫长的岁月中，病毒复制中的差异积累形成特定的基因型(genotype)，目前根据病毒株间基因序列的规律性差异，可将HBV划分为A~J共10个基因型，其中基因型A、B、C、F还可进一步划分为不同的亚型，而且不同基因型的分布具有明显的地域特征，不同基因型的病毒株可以混合感染。对PCR扩增产物进行限制性片段长度多态性分析后发现，我国主要流行的是基因型B、C，长江以北地区以基因型C较多，南方地区以基因型B为主，不同HBV基因型可导致前基因组水平的结构差异，对病毒抗原的血清转换率不同，这与HBV感染者的临床表现、抗病毒治疗效应、乙型肝炎重症化倾向及疾病转归均有关。由于HBV基因型分布具有地域特异性，其与乙型肝炎重症化关系的报道也存在差异。在亚洲地区，HBV基因型以基因型B、C为主，相对于基因型B而言，基因型C与严重肝病的关系更加密切，基因型C患者的血清HBeAg阳性率和HBV DNA载量较高，而HBeAg血清转换时间更长，体内血清转氨酶水平较高，肝组织炎症活动程度较重，说明基因型C感染者更容易发生重型肝炎。一项来自日本的多中心调查研究结果显示，在301例急性HBV感染者中，经多因素回归分析表明：Bj亚型是急性暴发性肝炎的独立预测因素之一。另一项来自美国肝衰竭研究小组为期3年的研究报道，在急性肝衰竭患者中基因型D的HBV慢性感染者所占比率高于基因型A、B、C的HBV慢性感染者，这个结果提示，基因型D可能是乙型肝炎重症化的预警指标之一。
2)HBV基因变异
自然界物种普遍存在变异，为适应环境谋求生存，HBV也具有变异性。HBV的高复制活性及病毒复制过程中HBV DNA聚合酶缺乏校正功能是HBV高度遗传变异性的基础，也是乙型肝炎发生和发展的必要条件。在慢性感染过程中，尤其是在抗病毒药物、疫苗和宿主免疫的多重选择压力下，病毒发生基因突变是较为常见的。HBV基因变异与临床的关系一直是HBV研究的热点，其与重型肝炎发病关系的研究已有较多报道。近年来，随着核苷(酸)类似物在临床上的广泛应用，一方面降低了乙型重型肝炎、乙型肝炎后肝硬化及肝癌的发生率，改善了患者的生活质量，另一方面也使HBV除自身的变异外，还出现了许多医源性变异，这使病毒表现出更复杂的变异态势，也使早期预测乙型肝炎重症化、处理HBV突变患者的临床实践问题变得更加棘手。
点突变发生在密码子第3位，没有引起编码氨基酸的改变，是一种同义突变，无生物学意义。若点突变发生在密码子第1、2位时，可能引起氨基酸的改变，成为错义突变，个别关键位置氨基酸的突变可改变病毒的表位，宿主只对原来的表位发生免疫应答，变异的病毒株可以逃避宿主的免疫清除而持续潜在感染。另外，HBV在核苷(酸)类似物长期作用压力下的变异，可改变基因序列中的药物有效靶位，从而发生耐药。
对从肝组织扩增出来的HBV DNA序列进行分析，发现基因突变可发生在所有开放读码框上，有时可能存在多个基因区段的突变，其中，最受关注且与乙型肝炎重症化关系报道最多的HBV突变是前C/C区变异：前C区1896位G-A的点突变终止变异和核心启动子区1762/1764双突变。普遍认为，HBV前C/C区是宿主对病毒免疫应答的关键位点，与感染HBV的肝细胞清除和肝细胞损伤密切相关。在人体免疫力作用下，前C区1896A位变异使第28位的密码子色氨酸(TGG)变异转变为终止密码(TAG)，使前C/C区编码的HBeAg合成提前终止，形成HBV前C区变异株，患者血清中HBeAg阴性，改变了宿主的免疫攻击靶点，导致免疫逃逸，但体内仍有病毒复制及疾病进展，容易发展为肝硬化、乙型重型肝炎，患者对抗病毒治疗无反应。在日本，前C区1896位终止变异被认为是暴发性肝衰竭的独立预测因素之一，能在88%~100%的急性肝衰竭患者中检测到。近期的研究发现，A1762T/G1764A和G1896A的三重突变显示出比A1762T/G1764A双突变更高的特异性。核心启动子区C1766T和T1768A双变异也与乙型肝炎重症化相关，这种变异正好位于C启动子远端核激素受体结合位点中，使核心启动子区产生类似核因子受体3的结合域，从而使HBV前基因组mRNA的转录加强，导致HBV DNA载量增加。此外有研究发现，前C区的A1846T突变和C区的T1753V突变与ACLF发生风险增加相关。其中A1846T突变是与HBeAg血清转换相关并能抑制HBeAg表达的独立因子。而T1753V突变与基因型C患者ACLF的发生有关，致病原因可能是1751-1778核苷酸区域编码了各种富含肝脏转录因子的结合位点，例如肝细胞核因子4，其上调BCP的转录。另有报道T1753V+A1762T/G1764A三重突变导致细胞培养过程中病毒复制增强，表明A1762T/G1764A单独或联合T1753V突变与患者血清高病毒载量相关。单独和组合这些突变可用作预测HBV相关ACLF发生的生物标志物。
HBV的外膜蛋白涉及病毒的嗜肝性、病毒颗粒的组装和分泌，以及诱导机体的特异性免疫应答。S区基因α决定簇G145R变异可产生乙型肝炎疫苗逃逸毒株或HBsAg阴性、HBV DNA阳性的乙型肝炎。该变异在许多乙型肝炎疫苗免疫中出现，抗-HBs免疫的个体仍能感染变异毒株，发生不同程度的肝炎，这就大大增加了临床诊断和治疗的难度。S抗原C138R突变株，HBsAg合成水平降低，特异性T、B淋巴细胞免疫所产生的中和性抗体减少，HBV不能及时被清除，导致乙型肝炎重症化倾向。同时这个HBsAg 138位点的变异导致HBV颗粒分泌受阻，在肝细胞内过度产生并积聚，直接引起肝细胞损伤和严重的肝炎病变。有学者发现，无法自愈的急性肝衰竭(ALF)患者的前S2区16-22或20-22残基存在缺失，且存在小乙型肝炎表面抗原(smallhepatitis B surface antigen，SHB)L49R位点的突变。其中前S区对HBV的生命周期至关重要，且含有T淋巴细胞和B淋巴细胞的抗原表位，该区域的缺失与CHB疾病进展相关。
P区基因编码逆转录酶，涉及酶的催化活性和核苷(酸)类似物的结合靶点。逆转录酶C区含YMDD(酪氨酸-甲硫氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸)的保守基序，有很高的酶活性。有关耐药变异与乙型肝炎重症化的研究不多，但在药物治疗之前，自然存在小部分rtV204或rtI2049劣势毒株，经L-嘧啶治疗后，原YMDD野生毒株受到抑制，rtM204I/V变异株由劣势毒株成为优势毒株，这样就降低了病毒对核苷(酸)类似物的敏感性，形成临床的耐药性，而变异毒株的感染仍然持续存在。日本学者报道rtL180I/V、rtL180M和rtM204I/V变异与乙型肝炎重症化相关。
另外，X区基因编码的HBx蛋白是高度保守的，虽然HBx的表达量不高，但它有复杂的生物学作用和不同的作用靶位。X区基因突变可使HBxAg合成紊乱，直接或间接影响肝细胞功能、病毒自身基因的转录调控和宿主细胞受损DNA的修复，进而影响乙型肝炎的疾病转归。
病毒变异因素是乙型肝炎重症化这一复杂病程的关键环节，有必要进一步深入研究HBV基因型和基因变异与乙型肝炎重症化的相关性，探讨其致病机制，为寻找乙型肝炎重症化的早期预警指标提供更多可靠的证据。
目前所报道的与乙型肝炎重症化相关的突变位点都并非乙型重型肝炎患者体内特有的，这些突变毒株是以劣势毒株或优势毒株的形式与野生毒株集合在一起，以准种形式存在于宿主体内的，是HBV与宿主、药物长期相互筛选的结果。因此，要研究病毒突变与乙型肝炎重症化的关系，必须考虑到HBV的准种特性。我国科学家通过克隆不同区域的HBV片段，发现HBV准种的复杂程度和准种多样性与乙型肝炎重症化密切相关。①重型CHB患者HBV S区准种的复杂程度大于HBV携带者及CHB患者，在HBV S区T淋巴细胞表位的第45、47、85位氨基酸上，CHB的准种构成情况比HBV携带者更复杂。因此，HBV基因组S区部分T淋巴细胞表位的准种构成差异可能与HBV慢性感染的临床转归相关。②有学者应用生物信息学分析方法研究了核苷(酸)类似物治疗早期CHB患者HBV逆转录酶(RT)区准种的动态变化及其与抗病毒疗效的相关性，并对无药物压力下CHB患者HBV逆转录酶(RT)区序列特征进行分析，发现CHB患者在拉米夫定治疗第4周时HBV的RT区准种的复杂程度和多样性在治疗应答组和无应答组中显示了两种截然不同的模式，应答组HBV在药物作用下的进化速率明显高于无应答组，可作为抗病毒治疗的预测指标之一。对恩替卡韦的进一步研究提示HBV准种复杂度在治疗早期显著降低可能是对核苷(酸)类似物抗病毒治疗应答的一般规律，而准种复杂度无明显变化甚至升高与治疗无应答和耐药相关。HBV准种的复杂程度和疾病的严重程度相关，研究病毒在患者体内演变及其与重症化的关系可为进一步探讨CHB患者耐药后发生重症化的机制提供依据。
3)病毒重叠感染
经临床研究发现，重叠感染戊型肝炎病毒(hepatitis E virus，HEV)的CHB患者发生重型肝炎的概率较高，肝组织的炎症活动程度更重。在慢性HBV感染的基础上重叠感染HEV，肝脏再经历一次急性炎症过程，肝细胞大范围变性和坏死，病情趋向重症化，提示当HBV和HEV重叠感染时，应尤其警惕乙型肝炎重症化倾向。
4)血清病毒水平
血清HBV DNA高载量提示HBV复制活跃和肝脏有病变活动，而血清HBV DNA低载量提示病变轻微，无须抗病毒治疗且传染性低。然而，在乙型肝炎重症化时，由于宿主免疫系统对HBV感染的过强应答和大范围肝细胞坏死，HBV DNA可被快速清除，血清HBV DNA和病毒抗原水平大多数不高，甚至阴性，进行血清病毒水平检测对乙型肝炎重症化的早期预警作用有限，临床上应理性分析血清标志物谱。
2.宿主因素
1)性别和年龄
男性与女性感染HBV的概率相同，但男性患者慢性化、重症化的概率要显著高于女性患者。感染时年龄越小，慢性化的概率越高。
2)宿主遗传因素
HBV感染人体可引起广泛的疾病谱，不同的个体感染HBV后临床结局差异很大。对同一种病毒，不同人群的易感性不同；对同一种抗HBV药物，不同个体产生的反应不同；对同一种HBV疫苗，不同个体可产生不同的免疫反应。这些均表明感染宿主对HBV有较强的遗传易感性。
(1)国内和国外在筛选和鉴定乙型肝炎重症化遗传易感性相关基因方面的研究比较少，主要集中在亚洲高发区人群，采用基于候选基因的研究策略，涉及乙型肝炎免疫反应信号通路的几个关键基因，如人类白细胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)基因启动子区、IL-10基因启动子区、干扰素诱生蛋白10(IP-10，CXCL10)启动子区等。
HLA区段最具有复杂多态性，人体参与免疫应答的基因位于HLA之内，以HLA表达的免疫遗传学基础可以解释对HBV易感的种族差异。故HLA免疫应答基因的多态性是重要的乙型肝炎易感性基因，是HBV感染发展和结局的重要影响因素。来自我国台湾地区人群的遗传相关性研究证明HLA-DRB1*1001等位基因及HLA-DRB1*1301、1302等位基因位点与乙型肝炎重症化、HBV感染的清除有关。我国科学家发现，HLA-DR是HBV-ACLF患者的主要遗传易感位点，且关联的风险等位基因与HBV-ACLF临床进程显著相关，风险等位基因rs3129859*C和HLA-DRB1*12：02可作为HBV-ACLF临床判断预后的标志物。其中rs3129859是HBV-ACLF的独立风险因素，是独立于慢性乙型肝炎自然史阶段、HBV再活化及肝硬化的因素，与凝血酶原时间(PT)及国际标准化比值(INR)呈正相关。近期的研究确定了HLA-DP易感性等位基因(DPA1*02：02；DPB1*05：01，*09：01)和保护性等位基因(DPA1*01：03；DPB1*02：01，*04：01，*04：02)，且这些等位基因在多名日本人、韩国人和中国人中具有高度一致性。此外，DPB1*01：01和DPB1*04：01分别被鉴定为欧洲裔美国人和非裔美国人中最易感和最具保护性的DPB1等位基因。在多个人群中也发现了具有一致效应的HLA-DQ和HLA-C等位基因，DQB1*03：02为保护性等位基因，而DQA1*06：01，DQB1*03：01，DQB1*06：01和HLA-C*07：02为易感性等位基因。
在非人类白细胞抗原区域，也存在HBV感染相关性基因。研究证实，TNF-α基因启动子区基因多态性(如308G/A和238G/A)与HBV持续感染有一定的相关性。TNF-α启动子区1031C、863A及TNF-β B2的等位基因频率可通过影响转录活性而使TNF-α表达水平不同，与乙型肝炎重症化显著相关。IL-10是一种强有效的趋化因子，IL-10基因启动子区的单核苷酸多态性(SNP)，如1082G/A、819C/T、592C/A等位点，与HBV感染后疾病的进展密切相关。Fas配体(FasL)与受HBV感染肝细胞的Fas结合，可诱导肝细胞发生凋亡，国内学者探讨FasL基因单核苷酸多态性与乙型重型肝炎之间的关系，经二元Logistic回归分析，控制年龄、性别等因素后，发现携带FasL-844CC基因型的非活性HBsAg携带者较易发生乙型重型肝炎。趋化因子在肝脏炎症和损伤中发挥重要的调节作用，有研究报道，趋化因子IP-10的高表达在肝细胞坏死性炎症中起重要作用。钠离子-牛磺胆酸钠共转运多肽(NTCP)经研究发现是HBV的功能性受体，且NTCP和HBV的L蛋白之间的相互作用是其进入肝细胞的关键。2017年我国科学家通过对1426例CHB患者、753例乙型肝炎肝硬化患者以及535例慢加急性肝衰竭患者的NTCP基因SNP位点(rs201339654，rs202018997，rs2296651，rs61745930和rs759531965)进行分析，发现相对于CHB患者来说，rs2296651(p.Ser267Phe variant)在慢加急性肝衰竭以及肝硬化患者中出现频率更高，通过Logistic回归分析发现，NTCP p.Ser267Phe variant是减少CHB患者向肝硬化以及慢加急性肝衰竭转换的保护因素。
目前，不同实验室对乙型肝炎的宿主遗传易感性的研究结果不完全一致，这可能与研究标本的来源和(或)标本所感染病毒的型别不一致有关，有必要结合宿主、病毒表型因素、环境因素，对多个关联的SNP位点综合考虑，全局、系统地认识以上各个与HBV感染相关的遗传基因多态性与乙型肝炎重症化发生的相关性。
随着人类单倍型图谱计划的完成和高能量SNP分型技术的出现，近年来，我国科学家利用更加权威的全基因组关联分析(GWAS)，开展了乙型肝炎重症化全基因组关联研究，完成了400例乙型重型肝炎患者和400例无症状HBV携带者对照的全基因组关联研究数据生物信息学解析，研究证实了5个与乙型肝炎重症化相关的分子靶标，即CXCL10-201G/A、IL10-592T/C、ESR1 IVS1-401T/C、TBX21-1993T/C、ICAM1 R241-E469。通过分析上述位点，有望从宿主全基因组角度评估影响乙型肝炎重症化的关键遗传变异位点，再从多基因、多位点的角度来全面说明乙型重型肝炎的遗传易感性，在临床上可对乙型肝炎患者进行风险评估，这些标记有助于实现乙型重型肝炎的精细分子分型、预警及早期诊断，为个体化治疗及预防提供新的、合理的策略，为早期预测和干预乙型重型肝炎的发生提供新思路。
(2)近年来，我国科学家对乙型肝炎重症化过程中的表观遗传学也进行了系统研究，他们以DNA甲基化为核心，以高通量甲基化芯片平台为基础，筛选并验证了若干关键位点的甲基化变化在乙型重型肝炎发病机制中的作用，研究发现了6个基因启动子区域甲基化(IL-17、GSTP1、IFN-γ、TNF-α、IL-10、GSTM3)与乙型肝炎重症化密切相关，其中GSTP1、GSTM3启动子区域的甲基化/去甲基化状态能够影响临床预后，可以作为判断临床转归的预警指标。另一种重要的表观遗传修饰方式——RNA沉默，其中微小RNA(miRNA)在乙型肝炎重症化免疫调控及临床转归中的作用越来越受关注。有学者利用miRNA芯片检测技术，通过GO数据库对miRNA调控的基因进行功能性分析及后期的临床验证，发现miR-122、miR-1187、miR-155等miRNA分子通过靶向调节炎症或细胞凋亡途径，对肝脏免疫功能和肝细胞凋亡的调节起到重要作用，这些分子有望作为判断肝衰竭时肝细胞损害程度的分子生物学标志物和治疗肝衰竭的靶标。随着高通量测序技术的发展，血清miRNA因其稳定、微创的特点而成为许多疾病早期诊断以及检测的靶标。经研究发现，血清miR-146a-5p，miR-122-3p以及miR-328-3p与慢加急性肝衰竭患者的肝脏炎症程度呈正相关，可以用来预测慢加急性肝衰竭患者病情的严重程度。另外，血清miR-130a在慢加急性肝衰竭患者预后良好组中较在慢加急性肝衰竭预后差组中表达高，可以作为慢加急性肝衰竭预后的潜在指标。我国科学家通过对慢加急性肝衰竭患者、CHB患者以及健康对照组的外周血单个核细胞(PBMC)进行miRNA测序，发现在慢加急性肝衰竭患者PBMC中有78种miRNA表达存在显著性差异，后续的PCR大规模验证，6个miRNA(hsa-miR-21-5p，hsa-miR-34c-5p，hsa-miR-143-3p，hsa-miR-143-5p，hsa-miR-374a-3p以及hsa-miR-542-3p)可以作为慢加急性肝衰竭诊断的潜在指标。有研究发现，与CHB相比较，8个miRNA(miR-548，miR-548i，miR-4462b，miR-4735-3p，miR-550a-3p，miR-944，miR-1471以及miR-4281)在慢加急性肝衰竭患者PBMC中的表达差异明显。进一步的生物信息学分析显示，这些miRNA多与基因表达调控以及代谢相关。越来越多的研究表明，血清miRNA可以作为乙型重型肝炎诊断及判断预后的指标。除miRNA外，有研究发现lncRNA也对肝衰竭的发生具有调控作用。人脂肪来源的干细胞(hASC)衍生的细胞外囊泡(EV)对ALF大鼠模型具有治疗效果，可提高大鼠的生存率。通过对大鼠肝脏进行基因测序发现，在hASC衍生的EV移植后人lncRNA H19表达增加。当H19编码序列在hASC中沉默后用于治疗肝功能衰竭的大鼠时，与用非沉默的hASC产生的EV治疗相比，ALF大鼠生存率降低至40％。表明lncRNA H19可能是治疗肝衰竭的潜在治疗靶标。我国有科学家发现对小鼠行肝脏部分切除术后不同时间点的肝脏进行lncRNA全基因组测序，证实lncRNA-LALR1通过抑制AXIN1的表达激活Wnt/β-catenin信号通路，促进细胞周期蛋白D1的表达和肝再生过程中细胞周期进程，加速肝细胞增殖。同样在人肝组织中也发现了lncRNA-LALR1的表达。靶向lncRNA-LALR1的药理学干预可通过诱导肝再生来治疗肝衰竭。
3)宿主免疫因素
肝脏富含各种可执行免疫功能的细胞，如单核-巨噬细胞系统、中性粒细胞、NK细胞、NKT淋巴细胞、各亚型T淋巴细胞等。肝脏免疫以天然免疫占优势，宿主感染HBV后产生由单核-巨噬细胞、中性粒细胞和NK细胞参与的早期免疫应答反应，肝脏也是特异性T淋巴细胞分化和执行功能的重要场所，参与机体局部或整体水平的免疫调节。乙型肝炎重症化过程主要是机体针对病毒的免疫应答产生免疫损伤的过程，肝细胞在短时间内大范围进行性凋亡或坏死，在此过程中肝脏天然免疫和特异性免疫之间相互作用，使肝脏微环境紊乱与肝细胞凋亡、坏死交织存在。除了免疫细胞外，白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子和趋化因子等细胞因子也在乙型肝炎重症化过程中起到了重要的免疫调控作用。
(1)天然免疫：
①单核-巨噬细胞系统：定植于肝脏血窦内皮间的单核-巨噬细胞，又称Kupffer细胞，占机体组织单核-巨噬细胞总数的80%以上，是肝脏天然免疫系统中的重要角色之一。Kupffer细胞不仅可以吞噬和清除肠道来源的微生物，降解内毒素、免疫复合物和一些毒性药物，维持内环境稳定，还与肝脏的细菌感染、病毒感染和免疫调节有关。肝脏最初的抗HBV应答是天然免疫应答，始于HBV激活肝脏的Kupffer细胞。一方面，Kupffer细胞可吞噬、清除HBV；另一方面，Kupffer细胞又被HBV激活，释放炎症介质进入血液中，再激活众多的炎性细胞，受趋化因子趋化，募集至肝脏，共同参与肝脏炎症反应。MERTK+细胞是一类表达酪氨酸激酶受体的单核-巨噬细胞。最近的研究发现，MERTK+细胞在慢加急性肝衰竭患者中数量增加，这类细胞可以下调机体对微生物产生的天然免疫反应。MERTK+细胞的表达与肝和肝外疾病的严重程度以及全身炎症反应相关，并且能降低体外培养的单核细胞对LPS的反应。因此，MERTK+细胞或许可以用于筛查高脓毒血症和高死亡率风险的重型肝炎患者，并为提早干预提供了新的思路。
在重型肝炎中，活化的单核-巨噬细胞释放的细胞因子复杂网络受到极大的关注，各炎症因子及其相关介质相互影响，共同参与乙型肝炎重症化的发生和发展，其中一些重要细胞因子或相关细胞表面分子有望成为乙型肝炎重症化的早期预警指标。
a.TNF-α：主要由活化的单核-巨噬细胞产生，是单核-巨噬细胞系统介导细胞毒作用的效应因子，也是重型肝炎和内毒素休克的关键性介质。TNF-α与TNFR结合可直接引起肝细胞凋亡或坏死，由HBV及其抗原致敏的肝细胞对TNF-α的细胞毒敏感性增加，更加大了肝衰竭的可能性。TNF-α还可以激活NF-κB、MAPK等炎症诱导信号，扩大IL-1、IL-6、IL-8、血小板活化因子(platelet activating factor，PAF)等细胞因子的生物学效应，增强单核-巨噬细胞系统中的呼吸暴发效应，诱导自由基产生，从而加重肝脏坏死。研究证实，HBeAg阴性的CHB患者未检出TNF-α，而大多数HBeAg阳性患者TNF-α水平增高。重型肝炎患者的血清和外周血单核细胞中TNF-α的水平显著增高，与肝脏炎症坏死程度一致，且该因子水平更高的患者预后更差。
b.活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)和活性氮簇(reactive nitrogen species，RNS)：单核-巨噬细胞系统经线粒体呼吸链和酶解反应后，可产生大量的具有直接细胞毒作用的ROS和RNS。ROS与细胞膜作用，产生脂质过氧化物和有细胞毒性的醛类，高浓度的ROS通过细胞氧化应激反应直接诱导细胞凋亡或坏死。在刀豆蛋白A诱导的暴发性肝炎模型中，单核-巨噬细胞系统及其释放的ROS是关键的致病机制之一，使用氯化钆耗竭单核-巨噬细胞或用自由基清除剂抑制ROS均可拮抗暴发性肝炎的发生。重型肝炎患者血清中NO水平显著升高，当肝脏炎症减轻，疾病进入恢复期时，NO水平又随之下降，提示NO可预示肝脏损害严重程度。
c.可溶性CD163分子(sCD163)：sCD163分子是单核-巨噬细胞系统特异性清道夫受体，能结合氧化修饰的低密度脂蛋白，它参与病原体的识别和清除，同时对一些衰老的红细胞和某些凋亡细胞有清除作用，从而发挥抑制炎症的作用。实验研究结果显示，急性肝衰竭患者外周血中sCD163水平显著升高，是平行对照组的10倍以上，这说明活化的单核-巨噬细胞参与急性肝衰竭的发病，当sCD163含量>26mg/L时，提示病情严重，预后差，有肝移植指征。sCD163联合KCC或MELD评分系统可以提高诊断乙型重型肝炎的敏感性，该分子有望成为评价急性肝衰竭预后的标志物。
d.hfgl2：属于纤维蛋白原家族成员，主要由活化的单核-巨噬细胞和血管内皮细胞表达，具有凝血酶原酶活性，可催化凝血酶原转化为凝血酶，启动凝血过程，参与纤维蛋白的形成及定位。相关研究发现，hfgl2在乙型重型肝炎组织活化的单核-巨噬细胞中高表达，启动局部的凝血过程，邻近肝组织有纤维蛋白沉积和大量微血栓形成，影响微环境供血，最终导致肝细胞坏死。同时hfgl2在慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure，ACLF)患者的外周血单核细胞中明显高表达，且其表达水平与肝病的重症程度密切相关，这表明hfgl2对于CHB的临床预后具有重要的预警作用。
e.人类白细胞抗原-DR分子(HLA-DR)：在急性肝衰竭患者外周血的CD14+单核细胞上HLA-DR表达水平显著下降，说明单核-巨噬细胞系统通过抗原呈递作用启动特异性免疫的能力减弱，免疫功能陷于“无能”状态，而且该分子表达下降伴随着血清IL-4、IL-6、IL-10和TNF-α等炎症因子水平显著上升，患者预后更差，提示监测乙型肝炎患者外周血单核细胞的功能状态(HLA-DR分子的表达程度)可以预测疾病进展及临床转归。
f.内毒素(endotoxin)：脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是其主要成分，LPS直接诱导自由基产生，导致肝细胞膜脂质过氧化，还可与TLR-4受体结合激活Kupffer细胞，产生大量炎症介质，引起肝脏微循环障碍，进一步加重肝脏坏死。在CHB的进程中，除肝实质细胞损伤外，肝窦周的Kupffer细胞功能由激活转为衰竭，Kupffer细胞对内毒素的清除作用减弱，极易发生肠源性内毒素血症，体内分解代谢增强，产生过量的氨，从而诱导肝性脑病的发生。因此，内毒素水平可反映肝病的进展程度。
g.IL-33：IL-33是IL-1家族的第11个新成员，又称IL-1F11，是一类“孤儿受体”ST2的配体。其不但可作为核内转录因子参与基因的表达调控，还可作为细胞因子被分泌到胞外，激活靶细胞，启动免疫反应。我国科学家通过检测收集的HBV-ACLF、CHB患者和正常对照人群的血液和肝脏样本中的IL-33/ST2水平，并与临床肝病严重程度进行相关性分析，发现血清与肝组织IL-33表达水平与HBV-ACLF疾病严重程度呈正相关；IL-33能显著增加单核细胞HLA-DR、CCR2和CD80的表达，促进细胞的抗原呈递功能，但不影响其吞噬能力；在内毒素环境下，IL-33通过ERK1/2磷酸化协同促进致单核细胞炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的释放。IL-33可作为内源性危险相关分子模式(danger-associated molecular pattern，DAMP)增强HBV-ACLF病程中的单核细胞炎症风暴，靶向性调节IL-33可能遏制肝脏炎症进展，以上结果为HBV-ACLF的早期诊治提供了新依据、新思路。
h.MIP-2：巨噬细胞炎性蛋白-2(macrophage inflammatory protein-2，MIP-2)，属于CXC趋化因子家族，是一种肝素结合蛋白，其功能主要是趋化并激活中性粒细胞到组织炎症部位。激活的中性粒细胞通过释放多种炎症介质(蛋白水解酶、花生四烯酸代谢物、活性氧等促炎性细胞因子)，直接导致肝细胞损伤；高迁移率族蛋白1(HMGB1)是细胞核中一种典型的非组蛋白，激活后的巨噬细胞可以将HMGB1分泌到胞外介导炎症反应。在肝脏炎症晚期HMGB1的释放可直接导致炎症的重症化，诱发机体免疫系统发生炎症因子风暴。MIP-2在急性肝衰竭发生和发展过程中不仅参与炎症反应时中性粒细胞的趋化激活，也参与了激活巨噬细胞诱导促炎性细胞因子的分泌。我国学者发现暴露于LPS的RAW 264.7细胞中MIP-2 mRNA的相对表达与LPS剂量呈剂量效应关系，用MIP-2 siRNA或MIP-2抗体干预LPS处理后的RAW 264.7细胞，可显著下调细胞培养液上清中IL-6、IL-1β、TNF-α及HMGB1的表达，抑制LPS导致的RAW 264.7细胞中的炎症反应，并且这种作用依赖于p38-MAPK、PIK/AKTs、JAK/STST信号通路。MIP-2重组蛋白能够直接刺激RAW 264.7细胞促进促炎性细胞因子的分泌，以及晚期炎症介质HMGB1的表达。以上结果表明MIP-2在巨噬细胞炎症反应中具有调控炎症的作用，且具有调控炎症晚期炎症因子风暴的作用，MIP-2是炎症晚期炎症因子风暴发生的一个关键的调节点，还可以通过调控TLR-4、CCL-2的表达，降低RAW 264.7细胞对LPS的敏感性，以及降低自身的趋化激活因子的分泌，来达到调控炎症发生和发展的作用。因此MIP-2可作为治疗肝衰竭的一个靶点进行进一步的开发研究。
i.CC趋化因子：单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)是一种主要作用于单核细胞、记忆性T淋巴细胞、树突状细胞和自然杀伤细胞的趋化因子；巨噬细胞炎性蛋白-3α(MIP-3α)是一种可参与树突状细胞、T淋巴细胞定向迁移的趋化因子，两者都属于CC趋化因子亚家族。有科学家发现与健康对照组和慢性肝衰竭患者相比，ACLF患者血清MCP-1和MIP-3α浓度显著提高。Leifeld等研究了由刀豆蛋白A和LPS诱导的肝衰竭小鼠模型中CC趋化因子释放的时间过程，发现肝内MCP-1和MIP-3α上调发生在肝脏浸润和肝脏损伤之前。此外，MCP-1和MIP-3α血清浓度的升高反映了肝脏的炎症程度。因此，MCP-1和MIP-3α的血清浓度可用作ACLF的早期预警指标。
②中性粒细胞：中性粒细胞是先天免疫系统的重要组成部分，在防御机体感染的过程中发挥重要作用。在HBV感染过程中，有效的抗病毒免疫固然重要，然而肝脏中的中性粒细胞积聚也会对宿主肝脏组织造成附加损害。中性粒细胞可以被诱导表达多种影响炎症反应和免疫应答的介质。在感染HBV的转基因小鼠中，抑制中性粒细胞弹性蛋白酶的表达可以改善肝脏损伤。肝细胞坏死过程中释放的TNF-α、IL-1、血小板活化因子、IL-8和脂质过氧化物等都是中性粒细胞外渗到肝实质的有效趋化因子，这些因子能完全激活中性粒细胞，延长其黏附依赖性的氧化应激和脱颗粒作用。同时中性粒细胞可以表达Fas配体诱导肝细胞凋亡，在肝脏炎症中发挥重要作用。在临床上，循环中性粒细胞功能指数是急性肝衰竭的重要生物标志物，中性粒细胞可能与器官功能障碍和败血症的易感性增加有关。临床用药发现粒细胞集落刺激因子治疗可以使外周血中CD34+细胞和中性粒细胞显著增多，并明显降低患者的CTP、MELD和SOFA评分，提高急慢性肝衰竭患者生存率。在失代偿期肝硬化患者尤其是器官衰竭患者中，中性粒细胞功能障碍导致的高氧化暴发作用和吞噬作用降低与患者死亡率增加相关。因此检测外周血中中性粒细胞的数量和功能可以及时反映机体的免疫活动。
③NK细胞：天然免疫系统的重要成员，是含有穿孔素和颗粒酶的非特异性细胞毒性淋巴细胞，在杀伤HBV感染细胞、分泌抗病毒细胞因子和抗肿瘤过程中起重要的防护作用。NK细胞的活性和功能与肝脏炎症反应程度显著相关，ALT水平升高时，NK细胞活性及脱颗粒效应逐渐增强。肝脏炎症时，NK细胞可大量募集并活化，分泌大量的干扰素-γ(IFN-γ)，并通过Fas-FasL、穿孔素-颗粒酶、NKG2D-NKG2DL等多种途径杀伤肝细胞。NK细胞通过分泌细胞因子IFN-γ和TNF-α来抑制病毒复制。有证据证明，乙型重型肝炎患者外周血中NK细胞比例低于轻度乙型肝炎患者和正常人，同时乙型重型肝炎患者肝脏中CD56+细胞数更高，肝内活化的NK细胞杀伤能力增强，可直接杀伤肝细胞导致肝损伤；而其分泌IFN-γ的能力则无明显变化，因此不能有效清除HBV，说明NK细胞是乙型肝炎重症化进展的重要致病机制之一，与乙型肝炎重症化有着密切联系。
(2)适应性免疫：
①细胞毒性T淋巴细胞(CTL)：以CTL为核心的特异性细胞免疫在清除细胞内病毒感染中起关键作用，同时也是造成肝细胞凋亡或坏死的重要因素，这一点与CHB病变和重症化密切相关。CTL免疫损伤机制主要如下：a.在早期CTL分泌IFN-γ等细胞因子，激活肝细胞内NF-κB基因，通过蛋白酶体途径有效地清除肝内HBV，形成非损伤性病毒清除作用；b.释放穿孔素、颗粒酶杀伤靶细胞，当乙型肝炎病情进展时，CTL受到HBV特异性抗原刺激后成为效应性CTL，释放大量的穿孔素和颗粒酶，对靶细胞进行杀伤，表现为细胞凋亡或溶解；c.HBV感染时，效应性CTL通过表达Fas配体(FasL)与受感染肝细胞的Fas结合，进一步激活胱天蛋白酶(caspase)级联反应，引发肝细胞凋亡。同时，CTL膜上Fas分子也可与FasL结合引起自身凋亡，下调免疫反应。在重型肝炎中，非特异性免疫效应可能来得更早，但特异性CTL的细胞毒性反应在很大程度上决定了乙型肝炎肝细胞的坏死程度，与乙型肝炎重症化发病有关。所以，特异性CTL的功能状态可反映病情的变化。
②Th17细胞：一种新发现的能够分泌IL-17的T淋巴细胞亚群，在自身免疫性疾病和机体免疫防御反应中具有重要的意义，主要分泌IL-17、IL-22、IL-21等炎症因子，其增殖、分化过程需要IL-6和TGF-β的参与，STAT3依赖性RORγ是其重要的转录因子。Th17细胞通过分泌IL-17募集并活化中性粒细胞和诱导趋化因子CXCL8的产生，在炎症反应中发挥重要作用。Th17细胞这一细胞群在乙型肝炎中的作用日益受关注，有研究表明，乙型重型肝炎患者外周血单个核细胞中Th17细胞比例要显著高于轻度乙型肝炎患者，且Th17细胞的增多与疾病的进展及肝脏炎症损伤的程度密切相关。同时，HBcAg通过诱导IL-10来逃避CHB时Th17细胞的细胞免疫压力。慢加急性肝衰竭患者外周血和肝脏组织中Th17细胞明显增多，Th17细胞水平与HBV DNA载量、血清转氨酶水平、凝血酶原活动度及肝内炎症程度密切相关，且Th17细胞浸润肝脏能募集并激活肝内浸润的单核细胞和髓样树突状细胞(mDC)分泌大量促炎性细胞因子，后者进一步加重肝脏损伤，以上研究结果说明Th17细胞在乙型肝炎重症化过程中起关键作用，在现有的检测指标基础上，增加监测Th17细胞水平和血清Th17浓度可更加精细地反映患者的免疫反应水平，对于早期预警乙型肝炎重症化并指导临床治疗具有重要意义。
③Treg细胞：一类具有免疫抑制功能的T淋巴细胞亚群，以CD4+CD25+Treg细胞为代表，主要通过接触抑制的方式抑制T淋巴细胞活化和增殖，Foxp3是其重要的转录因子。近年来，病毒特异性免疫调节细胞CD4+CD25+Treg细胞在乙型肝炎中的重要作用引起了广泛关注。Treg细胞以其免疫调节作用有效地抑制CTL功能，使HBV得不到有效的清除，这是乙型肝炎慢性化的主要机制。在这种慢性化过程中HBV DNA持续大量复制，也成为乙型肝炎重症化的隐患。有学者报道，在慢性乙型重型肝炎患者外周血单个核细胞和肝脏浸润的淋巴细胞中，CD4+CD25+Treg细胞的比例均显著高于慢性轻度乙型肝炎患者或健康者，且与HBV DNA载量呈正相关，CD4+CD25+Treg细胞还可抑制同型HBV特异性外周血单个核细胞的增殖。我国科学家还发现在ACLF的缓解阶段，患者外周血中Th17细胞增加，Treg细胞减少。Th17/Treg比率可能是预测ACLF进展的良好标志物，并且恢复Th17/Treg比率可以使ACLF患者的免疫系统保持稳定状态。以上研究结果表明，CD4+CD25+Treg细胞水平对于CHB的进程具有重要的提示作用。
④Tfh细胞：滤泡辅助性T淋巴细胞(Tfh细胞)是近年来发现的一种新型CD4+T淋巴细胞亚群，可特异性表达CXC趋化因子受体5(CXCR5)、诱导性共刺激分子(ICOS)、CD40等分子，其通过产生细胞因子IL-21，转录因子Bcl-6等辅助B淋巴细胞增殖、分化及免疫球蛋白类别转化，调节体液免疫反应，参与多种疾病进程。研究发现，与CHB和丙型肝炎(HC)受试者相比，HBV-ACLF患者外周血中CD4+CXCR5+ICOS+T(Tfh)细胞频数显著增高，并与MELD评分密切相关。Tfh细胞的增殖和分化受细胞因子IL-2和IL-21的调控。Tfh细胞频数在HC组、HBV携带者组、CHB组、HBV-LC组和CLF组中依次升高，且与TBil、DBil、AST、ALB、Tfh/Treg比率呈显著正相关。ACLF组血清IL-21水平明显高于HC组，MELD评分＞40分组血清IL-21水平明显高于MELD评分≤40分组，且与患者PTA呈明显负相关。此外Tfh/Treg比率在慢性 HBV 感染的各个临床阶段呈不同程度失衡，随着病情的进展，Tfh/Treg比率失衡的程度越明显，表明 Tfh/Treg 比率失衡在慢性HBV感染的发生、发展及转归中起了一定的作用。以上结果提示Tfh细胞和IL-21在肝衰竭的发病机制中发挥重要作用，形成以Tfh细胞为靶标的肝衰竭防治新策略十分重要。
⑤Tfr细胞：滤泡调节性T淋巴细胞(Tfr细胞)，源于Foxp3+Treg细胞，是一类新发现的专职调节生发中心(germinal center，GC)免疫反应的CXCR5+Foxp3+CD4+T淋巴细胞亚群，主要参与负性调控Tfh细胞诱导GC-B淋巴细胞的促GC反应，减少或抑制自身抗体的产生，在维持机体免疫耐受中发挥重要作用。在慢性HBV感染过程中大量自身抗体转阳，包括抗核抗体、抗线粒体抗体、抗平滑肌抗体等。其中抗可溶性肝抗原抗体(anti-SLA/抗SLA)是肝抗原自身抗体类型之一，有研究表明HBV-ACLF患者的抗SLA水平显著高于HC、CHB和LC患者，HBV-ACLF组中的Tfr细胞频数以及Tfr/Tfh比率明显低于HC、CHB和LC组，慢性HBV感染者中Tfr细胞频数与血浆中IL-10水平呈负相关，同时与血浆中分泌的抗SLA呈负相关，提示在肝衰竭状态下患者体液免疫环境发生了变化，Tfr细胞在HBV-ACLF患者高表达抗SLA中发挥了重要作用。综合以上研究，提示Tfr细胞在不同程度上参与了慢性HBV感染各阶段的致病过程，提示Tfr细胞与慢性乙型肝炎重症化相关，血清抗SLA水平或许可以作为判断其预后的参考指标之一。
⑥T细胞相关表面分子：
a.PD-1/PD-L1：属于CD28家族，是抑制性共刺激分子，主要表达在活化的T淋巴细胞、B淋巴细胞和髓系细胞上，能对免疫反应的产生起负性调节作用。彭国平等研究报道，CHB患者外周血抗原特异性CD8+T淋巴细胞上PD-1表达水平较急性乙型肝炎(AHB)患者和健康者明显升高，且PD-1的表达水平与HBV DNA载量呈正相关，抗病毒治疗可促使患者抗原特异性CD8+T淋巴细胞上PD-1水平下降，将PD-1/PD-L1信号途径阻断可显著促进CHB患者外周血单个核细胞的增殖和干扰素的产生。该分子的高表达可特异性抑制T淋巴细胞的免疫反应，影响活化T淋巴细胞对树突状细胞(DC)功能的活化，其抗病毒功能低下，与病毒持续感染有关。长期HBV抗原刺激诱导病毒特异性T淋巴细胞的PD-1表达上调，与同时被诱导表达增高的PD-L1形成抑制性信号途径来阻断机体过强的免疫反应，形成“刹车”效果，而这种负性调节机制在减轻肝脏损伤的同时，也增加了HBV免疫逃逸的机会，HBV DNA高水平复制，对炎性反应性减弱，反而容易导致重型肝炎的发生，并提示该分子可以作为乙型肝炎重症化早期预警指标来预测病情的转归。我国科学家通过免疫组化发现HBV-ACLF患者肝组织中PD-1+、PD-L1+和PD-L2+浸润细胞的数量明显高于CHB或健康对照组。以上研究表明这些分子可能有助于开发新的疾病诊断生物标志物或免疫疗法策略。
b.T淋巴细胞免疫球蛋白及黏蛋白分子-3(Tim-3)：属于T淋巴细胞免疫球蛋白及黏蛋白家族成员，Tim-3是一种细胞表面受体，主要表达在成熟的T淋巴细胞和CD11b+巨噬细胞中，是继PD-1之后又一具有负性调节功能的表面分子，对各亚群T淋巴细胞均有调控作用。有学者通过对CHB患者外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞中Tim-3的表达水平进行比较分析，证实，AHB和CHB患者CD4+和CD8+T淋巴细胞中Tim-3表达水平均高于正常对照组，重度CHB患者Tim-3+T淋巴细胞比例要高于中、轻度CHB患者，Tim-3+T淋巴细胞的比例与肝脏损伤严重程度呈正相关，而且Tim-3的血清水平与乙型肝炎重症化密切相关。当肝脏炎症反应减轻时，AHB进入恢复期，CD4+和CD8+T淋巴细胞中Tim-3的表达水平下降。此外我国科学家发现肝硬化失代偿期患者外周血CD14+单核细胞Tim-3的表达明显低于肝硬化代偿期患者和健康对照组，并且与血浆内毒素水平升高，细胞因子产生增加，吞噬能力降低和HLA-DR表达降低有关。与Tim-3-CD14+单核细胞相比，Tim-3+CD14+细胞具有更强的吞噬能力，有更高水平的HLA-DR、CD86、CD80、CD163和CD206表达，但CD1a和CD83表达水平较低。此外，在LPS刺激下Tim-3+CD14+细胞会产生更少TNF-α但是更高水平的IL-10。这些研究结果提示Tim-3可作为判断乙型肝炎病情严重程度的指标之一。(https://www.daowen.com)
c.前列腺素E2(PGE2)是在炎症反应过程中由花生四烯酸代谢生成的一种前列腺素类物质，是一种调节免疫平衡的免疫调节分子，目前已明确PGE2共有四型受体，分别为EP1、EP2、EP3和EP4。我国有研究人员发现，ACLF患者外周血CD8+T淋巴细胞上EP2的表达明显低于HC和CHB患者，且ACLF患者EP2阳性的CD4+T淋巴细胞和NK细胞也明显少于HC和CHB患者。外周血EP2阳性的CD8+T淋巴细胞数量与疾病的严重程度呈显著负相关。与HC和CHB组相比，ACLF患者血清PGE2水平明显升高，在ACLF患者中，最终发生感染的患者的PGE2水平也显著高于未发生感染的患者，ROC分析显示，血清PGE2(ROC曲线下面积，0.83)预测ACLF患者感染，敏感性为78.4%，特异性为81.5%，阈值为141pg/mL。以上研究表明，EP2或许可以作为一种新的生物标志物来预测肝衰竭患者的免疫状况和预后，而升高的PGE2血清水平可以作为ACLF患者发生感染的潜在生物标志物。宿主免疫因素在乙型肝炎重症化过程中扮演着至关重要的角色，通过阐明乙型肝炎重症化过程中宿主的免疫学特征，研究乙型肝炎重症化的免疫学发病机制，找出对乙型肝炎重症化倾向有早期预警作用的靶点，有针对性地以免疫学手段加以干预，有助于监控疾病发展和临床治疗，有效地延缓乙型肝炎重症化的进程，降低乙型重型肝炎发病率和病死率。
4)宿主代谢学因素
肝脏是人体处理代谢产物的关键器官，在维持机体代谢和内环境的平衡方面起着重要作用。重型肝炎患者由于肝脏功能严重受损，往往存在全身代谢紊乱。通过对患者代谢产物变化的动态分析，可以寻找能够判断乙型肝炎重症化发展阶段及预后状况的生物标志物。我国科学家通过血清肽谱分析发现，从慢性HBV感染进展至肝衰竭的不同阶段，患者的外周血血清肽谱表达存在显著差异，并建立了血清肽模型，来预测疾病的不同阶段。另外有研究发现，LCN2基因及其产物中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)在肝损伤实验模型中表达上调。临床研究也发现，LCN2基因在ACLF患者肝脏中表达显著上调，NGAL在这些患者的尿液和血浆中增加，并且尿液NGAL与IL-6、胆红素和国际标准化比值相关，结合尿液NGAL指标显著提高了MELD评分在预测结果方面的准确性。NGAL或许可以成为评估ACLF进展及预后的生物标志物。
目前，我国建立了气相色谱-质谱联用(GC/MS)和超高效液相色谱-质谱联用(UPLC/MS)技术为基础的代谢组学研究平台，对乙型肝炎重症化过程中各种疾病状态下的代谢谱进行研究，结合多元数据分析方法，鉴定出溶血卵磷脂、脂肪酰胺及胆汁酸等多个指标，可作为乙型重型肝炎患者病情、病程监测的预警指标。
5)宿主微生态特点
人体内共生微生物的构成与其健康状况密切相关。CHB患者多有肠道微生态失衡，肠道免疫屏障功能受损，肠黏膜定植抗力下降，细菌发生移位，形成内毒素血症，同时肠道氨产生增多，肝脏不能有效地将血中的氨转化为尿素，进而使血氨升高，促进乙型肝炎重症化发展。我国科学家对CHB、肝硬化及肝衰竭患者肠道微生物构成及代谢特点进行了详尽的研究和分析，首次报道慢性乙型重型肝炎和肝硬化患者特定的肠道菌群模式。CHB患者肠道双歧杆菌科/肠杆菌科值下降：肠道益生菌如双歧杆菌和乳酸杆菌明显减少，肠球菌和肠杆菌等潜在致病菌明显增加；肝硬化患者肠道中拟杆菌减少，变形菌、梭菌属增加；ACLF患者拟杆菌、疣微菌和毛螺旋菌丰度减少，巴斯德菌和链球菌增加，且并发肝性脑病的患者毛螺旋菌丰度明显减少，毛螺旋菌的相对丰度可作为预测患者死亡率的独立因素。肠道微生态失调的程度与内毒素血症升高、肝病严重程度密切相关。同时，探索肝病不同阶段特定的菌群模式，阐明肠道菌群变化对肝病进展及预后的机制，为指导临床积极预防乙型肝炎重症化具有积极意义。
6)细胞外囊泡(extracellular vesicle，EV)
细胞外囊泡指从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，是一组纳米级颗粒。其主要由膜微粒(microparticle，MP)、微囊泡(microvesicle，MV)和外泌体(exosome)组成，膜微粒是大小范围为0.1~1μm，源自许多细胞类型的膜片段；微囊泡是细胞激活、损伤或凋亡后从细胞膜脱落的小囊泡，直径为100~1000 nm；外泌体由细胞内的多泡小体与细胞膜融合后以外分泌的形式释放到细胞外，直径为40~100nm。EV广泛存在于细胞培养液上清以及血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁等中，携带有细胞来源相关的多种蛋白质、脂类、DNA、mRNA、miRNA等，反映了分泌细胞的生理状态和功能状态，从而提供了丰富的潜在的生物标志物分子源。有科学家发现急性肝损伤(ALI)和急性肝功能衰竭(ALF)患者的血浆中，直径为0.28~0.64μm的促凝血微粒的水平明显高于健康对照组，并且是ALI/ALF患者全身并发症和不良预后的独立预测因子。还有研究发现，在对乙酰氨基酚诱导的小鼠肝损伤实验期间，造血干细胞和血浆CD133 MP水平以CD39依赖性方式增加，而临床肝损伤患者CD39 MP的水平也会升高。提示CD133 MP可能在肝损伤模型中以CD39依赖性方式脱落，并且可能在临床中充当肝衰竭的生物标志物。
四、问题与展望
近年来，我国在乙型肝炎重症化方面的研究已经取得较大的进步，已经克隆了多个与乙型肝炎重症化相关的基因，发现了一些与免疫应答差异相关的遗传易感性基因，也已经筛选出一些与乙型肝炎重症化相关的病毒基因突变位点和多个对疾病进展有重要提示作用的分子靶标。尽管上述早期预警的各相关指标对重型肝炎的诊断具有重要的提示作用，但绝大多数指标是横断面研究的结果，尚缺乏大规模前瞻性随访跟踪研究来评价某个指标在早期预警和诊断方面的可靠性。乙型重型肝炎发病急，病情复杂，仅凭单个指标预测难以满足临床需要，也不符合实际应用要求。将来，随着后基因时代新兴起的蛋白质组学、代谢组学等多种技术的广泛应用，对乙型肝炎重症化的发病机制的进一步认识，研究者们需要综合考虑乙型重型肝炎患者的临床症状、实验室检查、HBV基因型、病毒变异、宿主遗传背景和免疫状态等多方面因素，深入探讨各因素间的有机联系和相应功能表现，将各因素用多因素Logistic回归模型加以分析，排除混杂因素的影响，建立有效的乙型肝炎重症化的早期预警评分系统，并发现一些简单、可靠、快速的诊断标志物，推广至社区应用，为广大乙型肝炎患者带来福音。
参考文献
［1］庄辉.加强乙型肝炎重症化的基础和临床研究［J］.中华肝脏病杂志，2010，18(4)：241-242.
［2］查锡良.医学分子生物学［M］.北京：人民卫生出版社，2006.
［3］成军.现代肝炎病毒分子生物学［M］.3版.北京：科学出版社，2015.
［4］Vernet G，Tran N.The DNA-Chip technology as a new molecular tool for the detection of HBV mutants［J］.J Clin Virol，2005，34(Suppl 1)：S49-S53.
［5］Peeters J K，Van der Spek P J.Growing applications and advancements in microarray technology and analysis tools［J］.Cell Biochem Biophys，2005，43(1)：149-166.
［6］吴仲文，李兰娟，马伟杭，等.慢性重型肝炎患者肠道定植抗力变化的研究［J］.中华肝脏病杂志，2001，9(6)：329-330.
［7］郭仁勇，陈珍晶，鲁海峰，等.慢性HBV感染者肠道真菌菌群生态结构研究［J］.中华微生物学与免疫学杂志，2009，29(11)：987-991.
［8］Chen Y，Yang F，Lu H，et al.Characterization of fecal microbial communities in patients with liver cirrhosis［J］.Hepatology，2011，54(2)：562-572.
［9］Cao Q Y，Chen F，Li J，et al.A microarray analysis of early activated pathways in concanavalin A-inducedhepatitis［J］.J Zhejiang Univ Sci B，2010，11(5)：366-377.
［10］Tan X F，Wu S S，Li S P，et al.Alpha-1 antitrypsin is a potential biomarker forhepatitis B［J］.Virol J，2011，8：274.
［11］He Q Y，Lau G K，Zhou Y，et al.Serum biomarkers ofhepatitis B virus infected liver inflammation：a proteomic study［J］.Proteomics，2003，3(5)：666-674.
［12］武立鹏，朱卫国.DNA甲基化的生物学应用及检测方法进展［J］.中华检验医学杂志，2004，27(7)：468-474.
［13］Park I Y，Sohn B H，Yu E，et al.Aberrant epigenetic modifications inhepatocarcinogenesis induced byhepatitis B virus X protein［J］.Gastroenterology，2007，132(4)：1476-1494.
［14］Zhu R，Li B Z，Ling Y Q，et al.Chronichepatitis B virus infection and the methylation status of p16INK4A promoter［J］.Zhonghua Zhong Liu Za Zhi，2007，29(3)：166-170.
［15］He Y，Zhao Y，Zhang S，et al.Not polymorphism but methylation of class Ⅱ transactivator gene promoter Ⅳ associated with persistent HBV infection［J］.J Clin Virol，2006，37(4)：282-286.
［16］Von Mering C，Jensen L J，Snel B，et al.STRING：known and predicted protein-protein associations，integrated and transferred across organisms［J］.Nucleic Acids Res，2005，33(Database issue)：D433-D437.
［17］宁琴，朱琳，严伟明.乙型肝炎重症化的早期预警［J］.中华肝脏病杂志，2010，18(11)：805-807.
［18］骆抗先.乙型肝炎基础和临床［M］.3版.北京：人民卫生出版社，2006.
［19］张琳，韩峰，吴丹，等.暴发性肝功能衰竭患者的临床特征及其预后的影响因素［J］.中华肝脏病杂志，2010，18(8)：614-617.
［20］李琴，贾继东，王宝思.凝血酶原时间及凝血因子在肝病中的应用［J］.中华肝脏病杂志，2004，12(12)：767-768.
［21］王建芳.血清胆碱酯酶活力测定在慢性乙型重型肝炎中的意义［J］.实用医技杂志，2010，17(9)：881.
［22］汪杨，辛桂杰，王峰，等.重型肝炎血氨检测的价值的研究［J］.临床肝胆病杂志，2008，24(3)：185-186.
［23］陶虎，高涛，徐斌.病毒性肝炎患者血清转铁蛋白临床价值再评价［J］.临床肝胆病杂志，2004，20(3)：148-149.
［24］李兰娟.传染病学［M］.北京：人民卫生出版社，2008.
［25］陈智，郑敏.乙型肝炎重症化相关分子靶标的研究进展［J］.中华肝脏病杂志，2010，18(4)：252-255.
［26］Takikawa Y，Endo R，Suzuki K，et al.Prediction ofhepatic encephalopathy development in patients with severe acutehepatitis［J］.Dig Dis Sci，2006，51(2)：359-364.
［27］Umemura T，Tanaka E，Kiyosawa K，et al.Mortality secondary to fulminanthepatic failure in patients with prior resolution ofhepatitis B virus infection in Japan［J］.Clin Infect Dis，2008，47(5)：e52-e56.
［28］张爱民，王慧芬，王海滨，等.HBV基因型与HBV感染慢性化、重症化的关系［J］.中华实验和临床病毒学杂志，2010，24(3)：178-180.
［29］Jeantet D，Chemin I，Mandrand B，et al.Characterization of twohepatitis B virus populations isolated from ahepatitis B surface antigen-negative patient［J］.Hepatology，2002，35(5)：1215-1224.
［30］Ozasa A，Tanaka Y，Orito E，et al.Influence of genotypes and precore mutations on fulminant or chronic outcome of acutehepatitis B virus infection［J］.Hepatology，2006，44(2)：326-334.
［31］Wai C T，Fontana R J，Polson J，et al.Clinical outcome and virological characteristics ofhepatitis B-related acute liver failure in the United States［J］.J Viral Hepat，2005，12(2)：192-198.
［32］佘为民.乙型肝炎病毒变异与重症肝炎关系探讨［J］.肝脏，2004，9(2)：121-122.
［33］侯金林，周彬.基因型和基因变异与乙型肝炎重症化的关系［J］.中华肝脏病杂志，2010，18(2)：85-87.
［34］Buckwold V E，Xu Z，Chen M，et al.Effects of a naturally occurring mutation in thehepatitis B virus basal core promoter on precore gene expression and viral replication［J］.J Virol，1996，70(9)：5845-5851.
［35］Melegari M，Scaglioni P P，Wands J R.The small envelope protein is required for secretion of a naturally occurringhepatitis B virus mutant with pre-S1 deleted［J］.J Virol，1997，71(7)：5449-5454.
［36］Xu Z，Yen T S.Intracellular retention of surface protein by ahepatitis B virus mutant that releases virion particles［J］.J Virol，1996，70(1)：133-140.
［37］Suzuki Y，Yotsuyanagi H，Okuse C，et al.Fatal liver failure caused by reactivation of lamivudine-resistanthepatitis B virus：a case report［J］.World J Gastroenterol，2007，13(6)：964-969.
［38］Doo E，Liang T J.Molecular anatomy and pathophysiologic implications of drug resistance inhepatitis B virus infection［J］.Gastroenterology，2001，120(4)：1000-1008.
［39］邓国宏，王宇明.宿主遗传背景与乙型肝炎重症化［J］.中华肝脏病杂志，2010，18(2)：88-91.
［40］Ogata N，Fujii K，Takigawa S，et al.Novel patterns of amino acid mutations in thehepatitis B virus polymerase in association with resistance to lamivudine therapy in Japanese patients with chronichepatitis B［J］.J Med Virol，1999，59(3)：270-276.
［41］Huang Y W，Hu C Y，Chen C L，et al.Human leukocyte antigen-DRB1*1101 correlates with less severehepatitis in Taiwanese male carriers ofhepatitis B virus［J］.J Med Virol，2009，81(4)：588-593.
［42］Thio C L，Thomas D L，Karacki P，et al.Comprehensive analysis of class Ⅰ and class Ⅱ HLA antigens and chronichepatitis B virus infection［J］.J Virol，2003，77(22)：12083-12087.
［43］Yan Z，Tan W，Zhao W，et al.Regulatory polymorphisms in the IL-10 gene promoter and HBV-related acute liver failure in the Chinese population［J］.J Viral Hepat，2009，16(11)：775-783.
［44］Miyazoe S，Hamasaki K，Nakata K，et al.Influence of interleukin-10 gene promoter polymorphisms on disease progression in patients chronically infected withhepatitis B virus［J］.Am J Gastroenterol，2002，97(8)：2086-2092.
［45］唐锋，何星星，常莹，等.Fas配体启动子区-844T/C单核苷酸多态性与重型乙型肝炎转归的关系［J］.中华传染病杂志，2011，29(5)：286-291.
［46］Deng G，Zhou G，Zhang R，et al.Regulatory polymorphisms in the promoter of CXCL10 gene and disease progression in malehepatitis B virus carriers［J］.Gastroenterology，2008，134(3)：716-726.
［47］李卓，李洪权，严艳，等.北京地区慢性乙型重型肝炎患者肿瘤坏死因子基因多态性相关性分析［J］.中华医学杂志，2007，87(30)：2105-2108.
［48］Xu X W，Lu M H，Tan D M.Association between tumour necrosis factor gene polymorphisms and the clinical types of patients with chronichepatitis B virus infection［J］.Clin Microbiol Infect，2005，11(1)：52-56.
［49］蒋业贵，王宇明.人类白细胞抗原-DRB1*1001与慢性乙型肝炎重型化密切关联［J］.中华肝脏病杂志，2003，11(4)：256.
［50］Zhu Q，Lu Q，Xiong S，et al.Hepatitis B virus S gene mutants in infants infected despite immunoprophylaxis［J］.Chin Med J，2001，114(4)：352-354.
［51］Tang Y Z，Liu L，Pan M M，et al.Evolutionary pattern of fullhepatitis B virus genome during sequential nucleos(t)ide analog therapy［J］.Antiviral Res，2011，90(3)：116-125.
［52］郁嘉伦，于德敏，姜节洪，等.乙型肝炎病毒基因S区准种特点与临床转归关系的初步研究［J］.中华临床感染病杂志，2011，4(1)：16-20.
［53］Chen L，Zhang Q，Yu D M，et al.Early changes ofhepatitis B virus quasispecies during lamivudine treatment and the correlation with antiviral efficacy［J］.J Hepatol，2009，50(5)：895-905.
［54］Liu F，Chen L，Yu D M，et al.Evolutionary patterns ofhepatitis B virus quasispecies under different selective pressures：correlation with antiviral efficacy［J］.Gut，2011，60(9)：1269-1277.
［55］Heijtink R A，Van Bergen P，Van Roosmalen M H，et al.Anti-HBs afterhepatitis B immunization with plasma-derived and recombinant DNA-derived vaccines：binding to mutant HBsAg［J］.Vaccine，2001，19(27)：3671-3680.
［56］胡家定，方婉珍.慢性乙型肝炎重叠戊型肝炎病毒感染与肝炎重症化关系的临床观察［J］.浙江临床医学，2001，3(4)：245-246.
［57］Tsuchiya N，Tokushige K，Yamaguchi N，et al.Influence of TNF gene polymorphism in patients with acute and fulminanthepatitis［J］.J Gastroenterol，2004，39(9)：859-866.
［58］梁红霞，江河清，余祖江，等.慢性重型乙型肝炎与HLA-DRB1*1301，1302等位基因的相关性研究［J］.临床医学，2004，24(2)：1-3.
［59］宁琴，武泽光，韩梅芳.宿主免疫应答与乙型肝炎重症化［J］.中华肝脏病杂志，2010，18(4)：246-251.
［60］Wieland S，Thimme R，Purcell R H，et al.Genomic analysis of thehost response tohepatitis B virus infection［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2004，101(17)：6669-6674.
［61］Ding W X，Yin X M.Dissection of the multiple mechanisms of TNF-alpha-induced apoptosis in liver injury［J］.J Cell Mol Med，2004，8(4)：445-454.
［62］Streetz K，Leifeld L，Grundmann D，et al.Tumor necrosis factor alpha in the pathogenesis ofhuman and murine fulminanthepatic failure［J］.Gastroenterology，2000，119(2)：446-460.
［63］Nagaki M，Iwai H，Naiki T，et al.High levels of serum interleukin-10 and tumor necrosis factor-alpha are associated with fatality in fulminanthepatitis［J］.J Infect Dis，2000，182(4)：1103-1108.
［64］Mller H J，Grnbaek H，Schidt F V，et al.Soluble CD163 from activated macrophages predicts mortality in acute liver failure［J］.J Hepatol，2007，47(5)：671-676.
［65］Nakashima H，Kinoshita M，Nakashima M，et al.Superoxide produced by Kupffer cells is an essential effector in concanavalin A-inducedhepatitis in mice［J］.Hepatology，2008，48(6)：1979-1988.
［66］Levy G A，Liu M，Ding J，et al.Molecular and functional analysis of thehuman prothrombinase gene(HFGL2)and its role in viralhepatitis［J］.Am J Pathol，2000，156(4)：1217-1225.
［67］朱帆，宁琴，陈悦，等.重型乙型肝炎患者肝组织中人纤维介素基因的检测及其与临床转归关系的探讨［J］.中华肝脏病杂志，2004，12(7)：385-388.
［68］Marsden P A，Ning Q，Fung L S，et al.The Fgl2/fibroleukin prothrombinase contributes to immunologically mediated thrombosis in experimental andhuman viralhepatitis［J］.J Clin Invest，2003，112(1)：58-66.
［69］Antoniades C G，Berry P A，Davies E T，et al.Reduced monocyte HLA-DR expression：a novel biomarker of disease severity and outcome in acetaminophen-induced acute liver failure［J］.Hepatology，2006，44(1)：34-43.
［70］Gao B，Radaeva S，Park O.Liver natural killer and natural killer T cells：immunobiology and emerging roles in liver diseases［J］.J Leukoc Biol，2009，86(3)：513-528.
［71］Zou Y，Chen T，Han M，et al.Increased killing of liver NK cells by Fas/Fas ligand and NKG2D/NKG2D ligand contributes tohepatocyte necrosis in virus induced liver failure［J］.J Immunol，2010，184(1)：466-475.
［72］Chen Y，Wei H，Gao B，et al.Activation and function ofhepatic NK cells inhepatitis B infection：an underinvestigated innate immune response［J］.J Viral Hepat，2005，12(1)：38-45.
［73］Zou Z，Xu D，Li B，et al.Compartmentalization and its implication for peripheral immunologically-competent cells to the liver in patients with HBV-related acute-on-chronic liver failure［J］.Hepatol Res，2009，39(12)：1198-1207.
［74］刘映霞，张鑫，刘敏，等.慢性乙型肝炎免疫细胞NKG2D表达在肝病重型化中的作用［J］.中国现代医学杂志，2006，16(13)：1970-1973.
［75］Mizuhara H，Uno M，Seki N，et al.Critical involvement of interferon gamma in the pathogenesis of T-cell activation-associatedhepatitis and regulatory mechanisms of interleukin-6 for the manifestations ofhepatitis［J］.Hepatology，1996，23(6)：1608-1615.
［76］Wu W，Li J，Chen F，et al.Circulating Th17 cells frequency is associated with the disease progression in HBV infected patients［J］.J Gastroenterol Hepatol，2010，25(4)：750-757.
［77］Zhang J Y，Zhang Z，Lin F，et al.Interleukin-17-producing CD4+ T cells increase with severity of liver damage in patients with chronichepatitis B［J］.Hepatology，2010，51(1)：81-91.
［78］Li J，Wu W，Peng G，et al.HBcAg induces interleukin-10 production，inhibiting HBcAg-specific Th17 responses in chronichepatitis B patients［J］.Immunol Cell Biol，2010，88(8)：834-841.
［79］Appay V，Dunbar P R，Callan M，et al.Memory CD8+T cells vary in differentiation phenotype in different persistent virus infections［J］.Nat Med，2002，8(4)：379-385.
［80］Li S，Gowans E J，Chougnet C，et al.Natural regulatory T cells and persistent viral infection［J］.J Virol，2008，82(1)：21-30.
［81］Xu D，Fu J，Jin L，et al.Circulating and liver resident CD4+CD25+regulatory T cells actively influence the antiviral immune response and disease progression in patients withhepatitis B［J］.J Immunol，2006，177(1)：739-747.
［82］Zhang X，Schwartz J C，Guo X，et al.Structural and functional analysis of the costimulatory receptor programmed death-1［J］.Immunity，2004，20(3)：337-347.
［83］彭国平，孙雯，孙箴，等.HBV感染患者外周血T细胞PD-1基因表达水平的变化与意义［J］.浙江大学学报(医学版)，2007，36(6)：553-560.
［84］彭国平，孙雯，吴炜，等.慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞PD-L1表达的相关研究［J］.浙江大学学报(医学版)，2008，37(4)：365-372.
［85］Peng G，Li S，Wu W，et al.PD-1 upregulation is associated with HBV-specific T cell dysfunction in chronichepatitis B patients［J］.Mol Immunol，2008，45(4)：963-970.
［86］Zhang Z，Zhang J Y，Wherry E J，et al.Dynamic programmed death 1 expression by virus-specific CD8 T cells correlates with the outcome of acutehepatitis B［J］.Gastroenterology，2008，134(7)：1938-1949.
［87］Zhu C，Anderson A C，Schubart A，et al.The Tim-3 ligand galectin-9 negatively regulates Thelper type 1 immunity［J］.Nat Immunol，2005，6(12)：1245-1252.
［88］Seki M，Oomizu S，Sakata K M，et al.Galectin-9 suppresses the generation of Th17，promotes the induction of regulatory T cells，and regulates experimental autoimmune arthritis［J］.Clin Immunol，2008，127(1)：78-88.
［89］Wu W，Shi Y，Li J，et al.Tim-3 expression on peripheral T cells subsets correlates with disease progression inhepatitis B infection［J］.Virol J，2011，8：113.