蛋白质及氨基酸代谢试验

二、蛋白质及氨基酸代谢试验

1.明胶液化试验

（1）原理：某些细菌可产生明胶酶，能使明胶分解为氨基酸，从而使明胶失去凝固力而呈液化状态。

（2）试验方法：将待检细菌以较大量穿刺接种于明胶培养基约2/3 高度，于20～22℃培养7～14 天，每天观察明胶液化现象。

（3）结果判断：明胶部分或全部液化，明胶液化试验阳性（图1-4-10）。

（4）注意事项

① 明胶培养基接种细菌后，一般要求在20～22℃培养，因为明胶一般在≤20℃时为固体，28℃时由固体向液体转变，≥35℃时为液体；多数细菌的明胶酶在20℃条件下孵育比在37℃下孵育能保持更强的活性、产生更多。

② 不同细菌进行穿刺接种培养后，液化的明胶可出现不同的形状（限于20～22℃培养），如漏斗状、杉树状、圆柱状等，但其特异性不够稳定，一般不能作为对某种细菌的鉴定依据，仅供参考。

③ 对于液化明胶速度慢的菌株，可在培养基中按2ml/100ml 的量加入甲苯，以增强细菌细胞壁的通透性，促使细胞内酶释放，以加快反应。因甲苯可能对某些菌株有抑制作用，所以同时设空白对照。

④ 试验中可根据待检菌的生长需要增加相应的营养成分，如动物血清，有些细菌（沙门菌属和葡萄球菌属）可产生需Ca2+的明胶酶，建议在培养基中按0.01mol/L 的量加入氯化钙。

（5）质控菌株，建议普通变形杆菌作为阳性对照，大肠埃希菌作为阴性对照。

2.吲哚试验

（1）原理：有些细菌利用自身的色氨酸酶来分解培养基中的色氨酸生成吲哚（靛基质），其再与试剂中的对二甲基氨基苯甲醛作用生成玫瑰吲哚。本试验主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。

（2）试验方法：将纯培养的待检细菌接种于蛋白胨水培养基中，36℃培养24～48h，滴加吲哚试剂，观察结果。

（3）结果判断：培养基表面呈红色为吲哚试验阳性；呈橙色为可疑；不出现红色为阴性（图1-4-11）。

（4）注意事项

① 因胰化酪蛋白胨含有丰富的色氨酸，试验更多采用此培养基。在使用普通蛋白胨时，也可加入少量色氨酸（0.2～1g/100ml）。

② 吲哚试剂应贮于带塞的棕色玻璃瓶中，并置4℃冰箱中保存。吲哚试剂性质不稳定，应同时进行吲哚阳性对照和阴性对照菌株的吲哚试验。

③ 吲哚试验中不宜使用含有颜色指示剂的培养基上的培养物，以免指示剂干扰吲哚的显色反应。

④ 质控菌株，建议大肠埃希菌作为阳性对照，克雷伯菌作为阴性对照。

3.苯丙氨酸脱氨酶试验

（1）原理：有些细菌产生的苯丙氨酸脱氨酶使苯丙氨酸脱氨后生成苯丙酮酸，加入三氯化铁试剂形成螯合物，产生绿色反应。(https://www.daowen.com)

（2）试验方法：取待检细菌涂布接种到苯丙氨酸脱氨酶琼脂培养基斜面上，36℃培养18～24h，向试管中直接自斜面上方滴加适量的10%三氯化铁试剂，轻轻转动试管使试剂布满斜面，1～5min 观察结果。

（3）结果判断：菌落生长处有绿色出现，苯丙氨酸脱氨酶试验阳性（+），菌落生长处无绿色出现，苯丙氨酸脱氨酶试验阴性（-）（图1-4-12）。

（4）注意事项

① 试验中应做较大量接种，加入三氯化铁试剂后转动斜面试管，使试剂与细菌、氧气充分接触，增加反应速度和强度，结果判断应立即进行，以不超过5min 为宜，延长反应时间会引起褪色。

② 质控菌株，建议普通变形杆菌作为阳性对照，大肠埃希菌作为阴性对照。

4.氨基酸脱羧酶试验

（1）原理：有些具有特异性脱羧酶的细菌能使氨基酸脱羧（—COOH）而生成胺和CO2，使培养基的pH 升高。最常用的氨基酸有赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸。

（2）试验方法：挑取细菌培养物分别接种不同氨基酸培养基和不含氨基酸的对照管内，上面滴加一层无菌液体石蜡，36℃培养18～24h，必要时可延长至48h，观察结果。

（3）结果判断：培养基呈紫色，氨基酸脱羧酶阳性反应（+）；培养基呈黄色，氨基酸脱羧酶阴性反应（-）（图1-4-13）。

（4）注意事项

① 接种前须将各种培养基及对照管做好标记，以免混淆而造成误判。

② 阳性反应为培养初期（10～12h）因葡萄糖发酵产酸使培养基变为黄色，继续培养则因氨基酸脱羧产胺（碱性）而又使培养基由黄色变为紫色；阴性反应因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。本试验在静置培养时可呈现黄色与紫色两层不同的颜色，判断结果时需轻摇试管，若已培养24h 则出现任何紫色的痕迹均判阳性。

③ 判断结果时，应与空白对照管进行比较，经培养后空白对照管必须为黄色，否则该试验无效。试验管出现任何紫色的痕迹都可判定为阳性结果。培养时间一般不应超过4 天，若时间过长，蛋白胨中其他氨基酸可以被分解产碱而出现假阳性。

④ 本试验主要用于肠杆菌科的鉴定，也可用于假单胞菌属、气单胞菌属、弧菌属等细菌的鉴定。弧菌属细菌进行该试验时需在培养基中加入NaCl（1g/100ml）。

⑤ 质控菌株，建议鼠伤寒沙门菌CMCC（B）50115 作为阳性对照，培养基呈紫色；普通变形杆菌CMCC（B）49027 作为阴性对照，培养基呈黄色。