酶类及其他试验

四、酶类及其他试验

1.氧化酶试验

（1）原理：氧化酶在有分子氧或细胞色素C 存在时可氧化，对二苯二胺出现紫色反应。本试验用于检测细菌是否有该酶存在。假单胞菌属、气单胞菌属等阳性，肠杆菌科等阴性，可区别。

（2）试验方法：将氧化酶试剂直接滴在固体培养基细菌的菌落上，或蘸取细菌菌落少许涂抹在白色的洁净滤纸上，加氧化酶试剂1 滴，立即观察结果。

（3）结果判断：滴加Kovacs 氏试剂，在15s 内观察结果，出现玫瑰红色至深紫色者为氧化酶阳性（+）；滴加Ewing 氏试剂，2min 内观察结果，出现蓝色为氧化酶阳性（+），否则为氧化酶阴性（-）（图1-4-15）。

（4）注意事项

① 对革兰阴性杆菌首先进行氧化酶试验，初步区分非常必要。

② 不能使用选择性培养基和（或）鉴别培养基上的细菌进行氧化酶试验，避免这些培养基的某些成分或指示剂颜色的干扰；因葡萄糖发酵可影响氧化酶活性，也不能使用含有葡萄糖的培养基。一般常用胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）、脑心浸液琼脂（BHI）。

③ 目前有商品化氧化酶试剂，按使用说明操作即可。试验时可以用一次性接种环或灭菌牙签将新鲜细菌单个菌落涂抹于白色滤纸上；因微量铁可引起对二苯二胺试剂氧化而导致假阳性结果，故不能使用含铁金属接种环。

④ 氧化酶试剂容易失效，应临用前新鲜配制。避光保存，建议将试剂分装在1～2ml 的安瓿瓶中置低温冰箱（-20℃）冷冻保存，临用前融化，融化后的不宜再保存使用。

⑤ 用Kovacs 试剂时，一般在10s 内观察结果，10～60s 出现阳性反应者为迟缓反应，60s 后仍不出现相应颜色反应者为阴性反应。对出现迟缓反应者，最好用含有血液的琼脂培养基上的新鲜培养物重新试验。

⑥ 质控菌株，建议用铜绿假单胞菌ATCC 27853 作阳性对照，大肠埃希菌ATCC25922作阴性对照。

2.过氧化氢酶试验（触酶试验）

（1）原理：具有过氧化氢酶的细菌能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧，出现气泡。革兰阳性球菌中，葡萄球菌和微球菌均产生过氧化氢酶，而链球菌属为阴性，故此试验常用于革兰阳性球菌的初步分群。

（2）试验方法（玻片法）：挑取固体培养基上的新鲜单个菌落置于洁净的玻片上，然后加1～2 滴3%过氧化氢溶液，静置，1min 内观察结果。

（3）结果判断：于1min 内产生大量气泡者为过氧化氢酶试验阳性（+），不产生气泡者为过氧化氢酶试验阴性（-）（图1-4-16）。

（4）注意事项

① 3%过氧化氢试剂不稳定，最好临用前配置于棕色瓶内，于4℃阴暗处保存。

② 红细胞中含有过氧化氢酶，当待检细菌营养要求高、需在含有血液的培养基上生长时，可使用巧克力琼脂培养基（红细胞已被溶解）进行过氧化氢酶试验。

③ 待检细菌必须是新鲜培养物，因为只有新鲜培养物才具有过氧化氢酶活性。老龄培养物可能会丧失酶活性，导致假阴性或弱阳性反应。

④ 试验时可以用一次性接种环或灭菌牙签将新鲜细菌单个菌落涂抹于玻片上。不可用含铁金属接种环，否则会导致假阳性反应。

⑤ 质控菌株，建议用金黄色葡萄球菌ATCC25923 作阳性对照，链球菌属细菌作阴性对照。

3.尿素酶试验

（1）原理：有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解而产生2 个分子的氨，使培养基变为碱性，使pH 指示剂（酚红）呈粉红色。不同细菌产生尿素酶的能力具有明显差异，尿素酶的测定是一项常规细菌生化鉴定指标，大肠埃希菌、沙门菌无尿素酶，培养基颜色不改变，则为阴性。

（2）试验方法：挑取18～24h 待检细菌培养物大量接种于改良Rustigian 尿素肉汤培养基管中，摇匀，于36℃±1℃培养10min、1h 和2h，分别观察结果。或大量涂布接种于Christensen氏琼脂斜面并浅穿刺（不要到达底部，留底部作变色对照），培养2h、4h 和24h，分别观察结果，如阴性应继续培养至4 天作最终判定。

（3）结果判断：培养基变为红色为尿素酶试验阳性（+），培养基仍为黄色为尿素酶试验阴性（-）（图1-4-17）。

（4）注意事项

① 尿素酶阳性反应出现的时间与接种量有直接关系。在一定范围内，接种量越大其反应出现的时间越短，但超过一定的接种量，反应速度不再无限度地加快。

② 仅斜面顶部呈现粉红色为弱阳性（弱+），仅斜面粉红色而底部无变化者为阳性（+），整个培养基均呈粉红色者为强阳性（2+）。

③ 质控菌株，建议用普通变形杆菌ATCC33420 作阳性对照，大肠埃希菌ATCC25922作阴性对照。

4.血浆凝固酶试验

（1）原理：病原性葡萄球菌能产生两种血浆凝固酶，一种是结合凝固酶，使血浆中纤维蛋白原变为不溶性纤维蛋白，附于细菌表面，生成凝块；另一种是游离凝固酶，不直接作用于血浆纤维蛋白原，能使凝血酶原变成凝血酶样物质，从而使血浆凝固。血浆凝固酶试验是鉴定葡萄球菌致病性的重要试验，用于常规鉴定金黄色葡萄球菌与其他葡萄球菌。

（2）试验方法：主要包括玻片法和试管法，玻片法主要测定结合凝固酶，试管法测定结合凝固酶和游离凝固酶。

① 玻片法：在洁净载玻片中央加1 滴生理盐水，取细菌新鲜纯培养物与其混合制成细菌悬液，经10～20s 观察，无自凝现象发生，则加入一滴兔血浆，与菌悬液混合，立即观察结果。(https://www.daowen.com)

② 试管法：取细菌新鲜纯培养物与0.5ml 兔血浆（经生理盐水1 ∶4 稀释）充分混匀，置36℃（水浴锅或恒温箱）中4h，每30min 观察1 次结果。同时设阳性对照及阴性对照。

（3）结果判断

① 玻片法：5～20s 有明显的凝块沉淀出现（稍前后倾斜载玻片更易观察），为血浆凝固酶阳性反应（+）；3～4min 后无凝固现象出现，为血浆凝固酶阴性反应（-）。

② 试管法：若4h 内试验管和阳性对照管全部或大部分出现凝固，而阴性对照管（不加兔血浆的浓菌液管）不发生凝固，为血浆凝固酶阳性（+）；无凝固为血浆凝固酶阴性（-）。对阴性和仅有小凝块者，放置过夜后再观察（图1-4-18）。

（4）注意事项

① 一般情况下，玻片法常用于初筛检验，对所有阴性反应和延迟阳性结果（超过20s）的均应做试管法证实。因为金黄色葡萄球菌的某些菌株玻片试验可能为阴性，而试管法对结合凝固酶和游离凝固酶均可检出。

② 试管法试验时，接种后及培养期间均不要振摇试管，因凝固初期的凝块很易破碎，且破碎后继续培养也难以形成凝块，导致假阴性结果。

③ 中间型葡萄球菌、猪葡萄球菌需要较长时间（4h 以上）孵育才可出现阳性。

④ 制备的细菌悬液要均匀，以便观察结果。

⑤ 质控菌株，建议表皮葡萄球菌作阴性对照，金黄色葡萄球菌作阳性对照。

5.氢氧化钾拉丝试验

（1）原理：革兰阴性细菌的细胞壁在稀碱溶液中易于破裂，释放出未断裂的DNA 螺旋，使氢氧化钾菌悬液呈现黏性，可用接种环搅拌后拉出黏丝来；革兰阳性细菌在稀碱溶液中没有上述变化。本试验主要用于革兰阴性菌与易脱色的革兰阳性菌的鉴别。

（2）试验方法：取1 滴4%氢氧化钾水溶液（应新鲜配制）于洁净玻片上，取新鲜菌落少许，与氢氧化钾水溶液搅拌混匀，并每隔几秒钟上提接种环，观察能否拉出黏丝。

（3）结果判断：用接种环拉出黏丝者为氢氧化钾拉丝试验阳性（+），仍为混悬液者为氢氧化钾拉丝试验阴性（-）。大多数革兰阴性菌于5～10s 出现阳性，有的需30～45s；60s 以后拉出黏丝者，判断为氢氧化钾拉丝试验阴性（-）（图1-4-19）。

（4）注意事项

① 4%氢氧化钾溶液应新鲜配制（即用前当日配制），否则易出现假阴性。4%氢氧化钾溶液与菌落比例应适当，如菌悬液太稀可出现假阴性。

② 革兰阳性细菌培养物如超过48h 可能会出现假阳性，因此必须使用新鲜细菌培养物。

6.CAMP 试验

（1）原理：B 群链球菌（无乳链球菌）能产生CAMP 因子，可促进金黄色葡萄球菌β溶血素活性，使血琼脂平板上的2 种细菌在划线交接处溶血能力增强，形成矢形（半月形）的透明溶血区。

（2）试验方法：在羊血或马血琼脂平板上，先将β 溶血的金黄色葡萄球菌划一横线接种，再将待检菌垂直划线接种，两者应相距0.5～1cm，于35℃孵育18～24h 后观察结果。每次试验应做阴阳性对照。

（3）结果判断：两种细菌划线交接处出现矢形（半月形）的透明溶血区为CAMP 试验阳性（+）（图1-4-20）。

（4）注意事项：建议选择金黄色葡萄球菌ATCC25923 或B 群链球菌作为阳性对照。

7.IMViC 试验

吲哚（I）、甲基红（M）、V-P（Vi）、枸橼酸盐利用（C）4 种试验常用于鉴定肠道杆菌，合称为IMViC 试验。大肠埃希菌对这4种试验的结果是++--（图1-4-21），沙门菌为-+-+（图1-4-22），产气肠杆菌为--++。常见肠杆菌科中IMViC 试验结果见表1-4-2。