一、糖类代谢试验

一、糖类代谢试验

1.糖（醇、苷）类分解试验

（1）原理：细菌对于糖（醇、苷）类的代谢，可分为需氧和厌氧两种。需氧代谢过程可将糖（醇、苷）类完全氧化，分解生成CO2和水；厌氧代谢过程对糖（醇、苷）类进行不完全分解（发酵），生成多种产物（如酸类等）。根据细菌对糖（醇、苷）类不同的分解能力进行细菌种类的鉴定，可用指示剂和发酵管检验。

（2）试验方法：取少许待检菌接种后培养，每天观察并记录结果，根据需要可培养观察10 天以上。

（3）结果判断：若待检菌分解糖（醇、苷）类产酸、产气则培养液变为粉红色，且在倒置的发酵管内有气泡形成，记产酸产气、反应阳性（⊕）；若仅产酸则培养液变粉红色，发酵管内无气泡，记产酸、反应阳性（+）；若不产酸则培养液不变色，发酵管内无气泡，记反应阴性（-）（图1-4-1）。

（4）注意事项

① 进行细菌种类的一般鉴定时，仅选用最有鉴别意义的糖（醇、苷）类。

② 对生长苛刻、营养要求较高的细菌需加入所需营养成分，如猪链球菌需在培养基中加入5%～10%的动物血清，副猪嗜血杆菌需在培养基中加入V 因子和5%～10%的动物血清等。

③ 培养基中蛋白胨的用量宜少，以免细菌利用蛋白胨产生过多碱而中和分解糖（醇、苷）类所产的酸，导致假阴性结果。

④ 用接种针或环取细菌纯培养物少许逐管进行接种时，注意使细菌充分乳化分散于培养液中；或用无菌的微量滴管吸取待检菌后，滴加1 滴（约20µl）即可。

⑤ 试验中如无特殊需要，对多种糖（醇、苷）类进行试验时，仅在葡萄糖管中加入发酵管，以观察分解葡萄糖是否产气，其他糖（醇、苷）类管均可不加。也可在液体培养基中加入0.3%～0.5%的琼脂使其成为半固体培养基，然后再进行穿刺接种。

2.葡萄糖氧化-发酵试验（O-F 试验）

（1）原理：不同细菌在有氧或无氧条件下对葡萄糖的分解能力及代谢产物不同，有氧条件下称为氧化（氧化型，O），无氧条件下称为发酵（发酵型，F），不分解葡萄糖称产碱型（NR）。葡萄球菌和肠杆菌科的细菌均为发酵型。

（2）试验方法：取纯培养的细菌同时穿刺接种2 管，接种后1 管滴加0.5～1cm 灭菌液体石蜡于培养基液面以隔绝空气，另一管不加，2 管同时在36℃恒温箱培养24～48h，观察结果。

（3）结果判断：两管均产酸变色为发酵型；两管均不变色为产碱型，仅开放管产酸变色而滴加液体石蜡管不变色为氧化型（图1-4-2）。

（4）注意事项

① 对于制备后保存时间较长的培养基，临用前需置沸水10min，以驱逐培养基中可能存在的氧气，迅速冷却后进行接种。

② 常用于培养基表面封口的试剂有以下两种。一是液体石蜡，在100ml 液体石蜡中加1ml 水，高压灭菌备用；二是凡士林与液体石蜡等量混合，高压灭菌后置110℃干热箱中烤干水分备用。

③ 对于阴性反应结果，需延长培养时间做最终判定。在记录结果时，一般用O（氧化）、F（发酵）和NR（产碱）符号表示，不用阳性或阴性表示，以免误解。

④ 质控菌株，建议氧化型细菌用铜绿假单胞菌ATCC27853、发酵型细菌用大肠埃希菌ATCC25922、产碱型细菌用粪产碱杆菌。

3.β半乳糖苷酶试验（ONPG 试验）

（1）原理：细菌分解乳糖需两种酶，一是β半乳糖苷渗透酶，可以使乳糖分子向细菌内渗透；二是半乳糖苷酶，能将乳糖分解为半乳糖和葡萄糖。同时含有上述两种酶的细菌能快速分解乳糖；具有半乳糖苷酶的细菌，只能在24～48h 内迟缓发酵乳糖；缺乏这两种酶的细菌不能分解乳糖。所有快速发酵或迟缓发酵乳糖的细菌均可分解邻硝基β 半乳糖苷（ONPG），生成黄色的邻硝基酚。本试验用于测定不发酵或迟缓发酵乳糖的细菌是否产生半乳糖苷酶，可快速鉴定迟发酵乳糖的细菌，如亚利桑那菌属与沙门菌属的鉴别。

（2）试验方法：挑取纯培养的细菌菌落混悬于无菌生理盐水中制备成浓厚菌悬液，加入甲苯1 滴，充分振摇，将试管置于37℃水浴中5min，加入ONPG 溶液0.25ml，混匀，置于37℃水浴，于30min、1h、3h 和24h 观察结果。

（3）结果判断：出现黄色判为阳性反应，通常在20 ～30min显色；不出现黄色可继续培养24h 作最终判定，无色为阴性（图1-4-3）。

（4）注意事项

① 本试验结果是以出现黄色判为阳性，不适合对产黄色素细菌的检验。

② ONPG 溶液不稳定，培养基呈黄色即不可使用。

③ 质控菌株，建议大肠埃希菌ATCC25922 作为阳性对照，奇异变形杆菌ATCC49005作为阴性对照。

4.三糖铁琼脂试验（TSI 试验）

（1）原理：三糖铁琼脂含有乳糖、蔗糖和葡萄糖（比例为10 ∶10 ∶1）。因培养基中葡萄糖的含量低，分解葡萄糖的细菌生成少量的酸，因接触空气而被氧化，使斜面逐渐变成红色；底部厌氧环境中的酸不被氧化，仍保持黄色。发酵乳糖和蔗糖的细菌则产生大量的酸，使培养基底部和斜面均呈现黄色。某些细菌能生成硫化氢（H2S），硫化氢和培养基中的铁离子反应，生成黑色的硫化亚铁沉淀。本培养基用于鉴别肠道菌发酵蔗糖、乳糖、葡萄糖及产生硫化氢的生化反应。

（2）试验方法：用接种环挑取待检菌的新鲜纯培养物，穿刺接种至培养基2/3 深度，并涂布斜面，置培养箱36℃±1℃培养18～24h。

（3）结果判断：若底部变黄，则分解葡萄糖产酸（acid，A）；若底部、斜面均变黄，表明分解乳糖和（或）蔗糖产酸（A）；若培养基变为红色，表明不分解葡萄糖、乳糖和（或）蔗糖，并有产碱（K）反应。需氧菌底部不生长，斜面变色；兼性厌氧菌底部、斜面均变黄；有的细菌对糖不分解，无产碱反应，在三糖铁琼脂培养基内生长，不变色（NC）。记录结果的顺序：斜面反应/底部反应/产气现象/H2S 产生。一般具体记录方式为：①酸/酸 （A/A）；②碱/酸（K/A）；③酸/酸，产气（A/）；④碱/碱（K/K）；⑤酸/酸，产H2S（A/A，H2S）；⑥无变化/无变化（-/-，或NC/NC）；⑦碱/无变化（K/-，或K/NC）；可疑反应用V表示（结果不定）（图1-4-4）。

（4）注意事项

① 本试验普遍适用对肠杆菌科细菌的初步鉴定。但有些肠杆菌如变形杆菌、沙门菌、志贺菌之间有相似反应，应与尿素酶试验同时进行。

② 本试验可采用克氏双糖铁琼脂（KI），不含蔗糖，制备与TSI 相同，接种、培养、结果判定等与TSI 基本一致，但KI 常应用于大肠埃希菌的初步鉴定。KI 虽可代替TSI，但两者的反应有所不同，因不发酵乳糖而发酵蔗糖的细菌在斜面上有不同的反应结果，如沙门菌在KI 上为K/（图1-4-5），在TSI 上为A/。

③ 培养基最好现配现用，或在临用前融化并重新凝固后使用。

④ 应使用接种针进行细菌接种，避免使用接种环。因后者可能会造成培养基琼脂破裂，影响结果观察。结果观察判定一般在培养18～24h 进行，时间过短可能会因糖发酵还未产生足够量的酸使指示剂改变颜色，时间过长则有可能因细菌利用蛋白胨产碱后改变pH，从而改变培养基颜色。

（5）质控菌株及结果判断见表1-4-1。

5.甲基红试验（MR 试验）

（1）原理：某些细菌分解葡萄糖形成丙酮酸，丙酮酸进一步分解成甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基pH 下降至4.5 以下。因甲基红指示剂变色范围pH4.4（红色）～6.2（黄色），加入甲基红指示剂即变为红色；一些细菌虽能分解葡萄糖，但产酸量少或将酸进一步分解为醇、酮、醛等中性产物，使培养基pH ＞6.2，加入甲基红指示剂变为黄色。该试验大肠埃希菌阳性、溶液呈红色，产气肠杆菌阴性、溶液呈黄色，可用于两者的鉴别。

（2）试验方法：将待检细菌的纯培养物接种于葡萄糖蛋白胨水培养基，36℃±1℃或30℃培养2～5 天。滴加1～2 滴甲基红试剂后立即观察结果。

（3）结果判断：呈红色为MR 试验阳性，呈橘红色为弱阳性，记为MR+；呈橘黄色或黄色为阴性，记为MR-。培养至第5 天仍为阴性，即可判定结果（图1-4-6）。

（4）注意事项

① 接种细菌的量应一致，菌液浓度不能超过109，否则抑制细菌生长。一般对阴性结果观察5 天以上。

② 试验表明，大肠埃希菌葡萄糖发酵产酸的能力比产气肠杆菌高6 倍以上，实际试验中可用于这两种细菌的鉴别。

③ 质控菌株，建议大肠埃希菌作为MR 阳性对照，产气肠杆菌作为MR 阴性对照。

6.维-培试验（V-P 试验）

（1）原理：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，再将丙酮酸脱羧生成乙酰甲基甲醇，后者在碱性溶液中被空气氧化后与培养基中的精氨酸等所含的胍基发生反应，生成红色化合物，为V-P 试验阳性。产气肠杆菌能生成乙酰甲基甲醇，V-P 试验阳性；大肠埃希菌不能生成乙酰甲基甲醇，V-P 试验阴性。

（2）试验方法：将待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基，36℃±1℃培养1～2 天，加入等量的V-P 试剂，36℃孵育，4h 内观察结果。

（3）结果判断：在培养基表面出现红色为V-P 试验阳性，无红色出现为V-P 试验阴性（图1-4-7）。

（4）注意事项

① V-P 试验常与MR 试验并列使用，一般两者呈相反结果，但并不绝对。

② 进行V-P 试验时，培养基不能含有牛肉膏（浸液），因为其含有乙酰甲基甲醇、二乙酰等物质，会产生假阳性结果。

③ V-P 试验一般用于肠杆菌属的鉴别。在用于葡萄球菌、芽孢杆菌等细菌时，通用培养基中的磷酸盐可阻碍乙酰甲基醇的产生。

④ 质控菌株，一般将产气肠杆菌作为V-P 试验阳性对照，大肠埃希菌作为V-P 试验阴性对照。

7.淀粉水解试验

（1）原理：有些分泌胞外淀粉酶的细菌能使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，淀粉水解后遇碘不再变蓝色。本试验可用于检测细菌是否产生淀粉酶和利用淀粉的能力。

（2）试验方法：待检细菌纯培养物点接种于淀粉琼脂平板或试管中，36℃±1℃培养24～48h，滴加少量的Lugol 氏碘液（革兰碘液也可以）于平板上或试管中，轻轻旋转，使碘液均匀铺满整个平板，2h 之内观察结果。

（3）结果判断：淀粉琼脂平板呈深蓝色、菌落周围出现无色透明环为阳性反应，说明淀粉被水解，根据菌落周围透明圈的大小可以判断待检细菌水解淀粉能力的强弱；菌落周围无透明环或试管液体为蓝色为阴性反应（图1-4-8）。

（4）注意事项

① 本试验几乎适用于各类细菌的鉴定，但实践中常用于链球菌的分型鉴别。

② 淀粉琼脂平板应现配现用，不宜保存于冰箱。在冰箱中常会使培养基变得不透明。一般保存2 周后淀粉琼脂平板上的淀粉发生变化，加入碘试剂会产生紫红色斑点。

③ 质控菌株，一般将枯草芽孢杆菌ATCC6633 作为阳性对照，大肠埃希菌ATCC25922 作为阴性对照。

④ 枯草芽孢杆菌在36℃±1℃培养24～ 48h 会长成一片，建议在25℃培养3～7 天，滴加碘液后于2h 之内观察结果。

8.七叶苷水解试验

（1）原理：有些细菌能水解七叶苷生成葡萄糖和七叶素。七叶素可与培养基中枸橼酸铁二价铁离子发生反应，形成一种黑色化合物，使培养基变黑。本试验主要用于D 群链球菌与其他链球菌的鉴别。

（2）试验方法：将被检菌接种于七叶苷培养基中或胆汁七叶苷培养基，36℃培养18～24h 观察结果。

（3）结果判定：培养基完全变黑为阳性，不变黑为阴性（图1-4-9）。

（4）注意事项

① 本试验主要用于D 群链球菌与其他链球菌的生化鉴别，前者阳性，后者阴性。

② 因高浓度的胆盐具有抑制除D 群链球菌以外的多数链球菌生长，所以常选择胆汁七叶苷培养基，也可以选择胆汁七叶苷叠氮钠琼脂培养基（添加50ml/L 马血清），能抑制G-细菌生长，通常作为初步选择性的培养基使用。

③ 质控菌株，建议嗜水气单胞菌作为阳性对照，温和气单胞菌作为阴性对照。