一、纸片扩散法

纸片扩散法是在已经接种测试菌的琼脂表面贴上含有定量抗菌药物的滤纸片，纸片中的药物在琼脂中扩散，并以纸片为中心形成一定的浓度梯度，因此，测试菌株会在纸片周围形成不同大小的透明抑菌圈，抑菌圈的大小可以直接反映测试菌对药物的敏感程度。该方法操作简便，对实验室及操作人员要求不高，因此该法是兽医临床上最常用的药敏试验检测方法之一。其具体操作步骤见图2-4-1。

1.材料准备

待测细菌、MH 琼脂平板、无菌生理盐水、药敏试纸、酒精灯、无菌棉签、微量移液器、弯头眼科镊等。

2.涂布测试菌株

用无菌棉签挑取3～5 个菌落浸入无菌生理盐水中制备成菌悬液。用棉拭子蘸取菌悬液后在试管上壁轻轻挤压以挤去过多的菌液，含菌液的棉拭子在琼脂表面均匀涂抹，琼脂平板每次转60°，最后沿平板内缘涂抹一周，使菌液均匀涂满整个平皿。

图2-4-1　纸片扩散法药敏试验操作流程

（a）材料准备；（b）制备菌悬液；（c）涂布菌液；（d）贴药敏纸片

3.贴药敏纸片(https://www.daowen.com)

镊子经酒精灯火焰灭菌并略停数秒冷却后，夹取药敏纸片贴到涂布菌液的培养基表面。用镊子轻按几下药敏片，使药敏片与培养基紧密相贴。药敏纸片间应留有适当的空间，并尽可能有规律地分布，通常一块平皿可同时贴5～6 片药敏纸片（图2-4-2）。

图2-4-2　药敏纸片贴布示意

4.细菌培养及结果判定

将平皿倒置于37℃恒温培养箱中培养12～24h，培养后通常会形成一个抑菌圈，若无抑菌圈，则表示该菌对此药耐药［图2-4-3（a）］。可用游标卡尺测量抑菌圈大小［图2-4-3（b）］，并记录结果。抑菌圈的大小与药物敏感性呈正相关，即抑菌圈越大则说明该菌对此药敏感性越高，反之敏感性越低。

图2-4-3　纸片法药敏结果判定示意

（a）药敏结果示意；
（b）用游标卡尺测量抑菌圈直径