沙门菌属（Salmonella）

第二节　沙门菌属（Salmonella）

沙门菌属隶属于肠杆菌科，是一群寄生于人和动物肠道内的革兰阴性杆菌，生化特性和抗原结构相似。根据DNA 杂交技术，本菌属可分为2 个种，分别为肠道沙门菌（S.enterica）和邦戈尔沙门菌（S.bongori）。肠道沙门菌可分为肠道亚种（enterica）、萨拉姆亚种（salamae）、亚利桑那亚种（arizonae）、双亚利桑那亚种（diarizonae）、豪顿亚种（houtenae）、英迪加亚种（indica）6 个亚种。沙门菌属的血清型已超过2 500 种，除20 个血清型属于邦戈尔沙门菌外，其余均属肠道沙门菌，99%对人和动物致病的菌株属于肠道沙门菌肠道亚种（Salmonella enterica subsp.enterica）。肠道沙门菌肠道亚种有超过1 450 种血清型，较为常见的有猪霍乱、肠炎、鸡伤寒、伤寒、副伤寒、鼠伤寒等。

在历史文献中，沙门菌的命名通常以所致疾病名称、分离菌的地名、人名等多种方式表示。目前的命名方法规定肠道沙门菌肠道亚种给予专用名，并采用标本分离地址的地名。有关沙门菌的书写形式目前国内没有明确规定，纵观全球范围也没有统一推荐的书写形式。

1.形态染色

沙门菌的形态和染色特性与肠杆菌科大多数其他菌属相似。革兰阴性、直杆状、大小（0.7～ 1.5）µm×（2.0～5.0）µm，菌落直径2～4mm。除鸡沙门菌和雏沙门菌等无鞭毛、不运动外，其他菌绝大多数具有Ⅰ型菌毛，且均以周生鞭毛运动。沙门菌属的镜检形态见图5-2-1。

2.培养特性

（1）培养条件：沙门菌的最适宜培养温度为37℃，鸡沙门菌和雏沙门菌等少数菌能在肉汤琼脂上形成较小的菌落，生长较为贫瘠，大多数菌株在肠道杆菌鉴别培养基或选择性培养基上，形成不发酵乳糖的无色菌落，呈现S-R 变异。在培养基中加入血清、葡萄糖、硫代硫酸钠、胱氨酸、甘油和脑心浸液等，均有助于本属细菌的生长。

（2）常用培养基上的生长形态：沙门菌在伊红-亚甲蓝培养基、麦康凯琼脂、血平板、营养琼脂上生长呈无色菌落（图5-2-2～图5-2-5）。在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板（XLD）上生长呈淡红色、红色黑心的菌落（图5-2-6）。在脱氧胆酸盐枸橼酸盐琼脂平板（DHL）上生长呈黑心菌落（图5-2-7）。在科玛嘉显色培养基上呈紫红色菌落（图5-2-8）。

3.生化反应

本属细菌兼性厌氧，大部分可产生过氧化氢酶，但不产生氧化酶，利用枸橼酸盐能使赖氨酸和鸟氨酸脱羧基，但对苯丙氨酸和色氨酸均不脱氨基。发酵葡萄糖产酸产气，不发酵乳糖，不能利用水杨苷、蔗糖、侧金盏花醇和棉籽糖，也不能产生α 甲基葡萄糖苷。不产生吲哚，不分解尿素，甲基红试验呈阳性，V-P 试验呈阴性，在三糖铁琼脂上常产生H2S。大多数沙门菌在含铁培养基上能产生H2S，在三糖铁琼脂上的生长详见图5-2-9。

沙门菌属生化试验项目较多，大多数项目是用于菌属间的区分，有些用于区分亚种，只有少数试验用于区分属内血清型。1976—1980 年，我国沙门菌菌型分布调查组对19 729 株沙门菌所做的生化试验结果与国外报道基本一致，详见表5-2-1。

4.分离鉴定

（1）沙门菌属分离鉴定流程：若被检组织未污染，则直接接种于普通琼脂、血琼脂或鉴别培养基；若被检材料已被污染，则经普通预增菌培养基培养后，再进行选择性增菌培养基进行增菌，然后再用鉴别培养基分离培养。普通预增菌培养基常选用蛋白胨水；选择性增菌培养基常选用亚硫黄酸盐增菌液、亚硒酸盐增菌液、亮绿-胆盐-四硫黄酸钠肉汤以及亮绿-胱氨酸-亚硒酸氢钠增菌液等；鉴别培养基常用伊红-亚甲蓝、麦康凯、去氧胆盐钠-枸橼酸盐、SS 和HE 等培养基，某些情况下可选用亮绿中性红和亚硫酸铋等琼脂培养基。大肠杆菌发酵乳糖，而多数沙门菌不发酵乳糖，在颜色上可做区分。

分离鉴定时，在鉴别培养基上挑取待检菌落分别作纯培养，同时分别接种尿素琼脂培养基和三糖铁（TSI）琼脂，37℃培养24h。若培养反应结果与沙门菌特征相符，取TSI 琼脂培养物或与其相应菌落的纯培养物再进行O 抗原群和沙门菌生化特性的鉴定，可采用O 抗原单因子血清做进一步的血清型分型。沙门菌的分离鉴定程序详见图5-2-10。

（2）生化鉴定

① 沙门菌属与其他相似细菌的鉴别：沙门菌属与其他相似均属的鉴别见表5-2-2。在沙门菌属中有几个血清型的抗原式是相同的，但分类为不同的血清型，因为这些型之间有很明显的生化差异，本书着重介绍O：7 群具有相同抗原式（6，7：c：1，5）血清型的生化区别，见表5-2-3。

目前已经有包括分子生物学在内的诸多技术能够用来更准确地鉴别沙门菌，但是作为分类学经典的理论和实践的一部分，亚种间生化表型的鉴别意义要大于同菌群中的几个不同血清型的鉴别。

② 沙门菌血清型鉴定：沙门菌属具有O、H、Vi 三类性质不同的抗原。O 抗原是细菌脂多糖的最外层结构，为耐热性菌体抗原，由多糖-磷脂复合物组成，对乙醇和弱酸有耐受性；H 抗原是细菌鞭毛的纤维结构，不耐热；Vi 抗原又称荚膜多糖抗原，仅存在于伤寒和丙型副伤寒等少数特定血清型中。因此，一般情况下仅鉴定O 抗原和H 抗原即可确定沙门菌相应血清型。目前可通过采购商品化的沙门菌分型诊断血清来确定细菌抗原组成，即鉴定其血清型。

沙门菌血清型鉴定可用沙门菌属诊断血清通过凝集试验来进行确定。做O 抗原鉴定时，可用普通琼脂培养物做玻片凝集试验；鉴定H 抗原时，应使用新制备的0.8%～1.1%软琼脂培养物，以免因鞭毛生长不良而导致假阴性反应。血清应严格按生产厂家的使用说明中规定的操作程序进行试验。玻片凝集试验应先做O 多价血清，再做O 单价血清，确定O 群后再做H 多价血清及H 单价血清。从效率上讲，先直接用较常见的O 抗原4、7、9、10、11、19 因子分1 次或2 次集中进行玻片凝集；若存在交叉凝集现象者，以肉眼判断，凝集颗粒粗、背景清者为标准确定血清群；以上若不凝集者，用剩余的“O”8 因子；仍然不凝集者，再用A-F 多价血清重新进行确认。H 相位主要依靠“H”多价不同的组成进行。如果遇到“H”因子血清交叉凝集时，要综合比较血清凝集的颗粒、相关血清型是否属于较为常见的型别、是否有辅助生化指标来鉴别发生交叉凝集现象血清型的差异。

（3）分子生物学鉴定

① 沙门菌核酸检测方法：沙门菌核酸检测方法有多种，但商品化的用于检测的只有DNA 探针、PCR 和噬菌体技术3 种。

DNA 探针技术：已经被开发用于多种食源性病原菌的检测，探针技术检测的对象主要是rRNA，具有高灵敏度的特点。GENE-TARK 检测试剂将DNA 杂交技术和酶联免疫检测技术（EIA）结合在一起对包括沙门在内的多种病原菌进行检测。GEN-PROBE 的AccuProbe及acne 试剂是一种杂交保护试剂，采用一个化学发光标记的单链探针与16SrRNA 的特定序列进行杂交。AccuProbe 试剂主要用于细菌纯培养分离物的鉴定。

聚合酶链式反应（PCR）：可采用商品化的试剂盒进行沙门菌的检测，也可以针对16SrRNA 设计引物建立PCR 方法。PCR 方法可在2h 内把1 个单拷贝DNA 扩增100 万倍，具有快速、特异的特点。

噬菌体技术：有一种噬菌体检测方法是用于沙门菌属检测的细菌冰成核诊断（BIND）技术。BIND 方法检测灵敏度最低可达20 CFU/ml，但一般在102～104CFU/ml 之间，取决于所检测沙门菌血清型的不同。

② 沙门菌抗体检测方法：包括乳胶凝集、免疫扩散、免疫沉淀、ELISA、免疫磁珠分离5 种方法。

乳胶凝集（LA）：虽然LA 检测沙门菌属已得到认可，但检测前需要进行多步骤的增菌，而且有时候悬浮的颗粒也会影响对凝集结果的判断。LA 主要用于分离菌落进行快速血清学鉴定。

免疫扩散：是一种简单的检测病原菌的抗体检测方法。目前使用这种方法的商品化试剂只有沙门菌1～2 检测方法。当扩散的抗体接触到鞭毛抗原时，就会形成一条肉眼可见的沉淀带，这种方法不能检测出不能运动的沙门菌。

酶联免疫吸附试验（ELISA）：是最常用的抗体检测方法。目前商品化的ELISA 试剂盒已非常成熟，对细菌的检测灵敏度为104 ～105 CFU/ml，但在检测前必须进行增菌培养。

免疫磁珠分离（IMS）：在检测沙门菌的过程中，特异性抗体与磁性颗粒或微球偶联后可用来捕捉增菌培养基中的目标菌。目前有富集免疫磁珠全自动仪器完成这一过程，通过IMS 纯化的细菌可以转种到选择培养基上进一步检测，也可以通过血清学、基因学或其他方法进行鉴定。

③ 毒力基因和耐药基因检测：毒力基因作为菌体的遗传物质，其编码产生的相关毒力蛋白会影响菌体的耐受能力及毒性，编码产生相关毒力蛋白的毒力基因多数位于毒力岛上，少数位于毒力质粒上。可参照国外文献用PCR 方法检测沙门菌属毒力岛核心蛋白基因：invA、orgA、prgH、spaN（invJ）、tolC、sipB、pagC、msgA、spiA、sopB、lpfC、pefA、spvB、sifA。其中，invA、orgA、prgH、spaN（invJ）、tolC、sipB、pagC、msgA、spiA、sopB、lpfC、pefA、spvB、sifA 编码的蛋白与侵袭特性有关；sitC 和iroN 对毒力很重要，且与铁元素的摄取有关；pefA、iron、cdtB、sipB 和spaN（invJ）在小鼠模型中对沙门菌毒力的完整性是必需的。

沙门菌的耐药问题日益严重，给沙门菌病的预防和控制带来很大困扰。可用PCR 方法对沙门菌的I 类整合酶基因Intl I 和13 个耐药基因进行检测，包括β 内酰胺酶类抗生素耐药基因blaTEM、blaPSE、blaOXA、blaCMY；喹诺酮类抗生素耐药基因qnrA、qnrB、qnrS、qnrC、qnrD；磺胺类抗生素耐药基因sul1、sul2；氯霉素类抗生素耐药基因cat I 和氨基糖苷类抗生素耐药基因aac（6′）-Ib-cr。引物序列和退火温度见参考文献。

④ 分子分型检测：沙门菌主要依靠细菌表型（如血清）或生化进行分型，但在对同一血清型不同菌株间的同源性鉴定方面，比如是否为暴发或是散发的同源株或仅仅表现为相同血清型但流行病学为不相关的克隆株，传统的实验室分型方法已无能为力。

近年来，以脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）技术为基础的分子生物学分型方法广受重视，被认为是进行分子分型的可信方法之一。PFGE 是对细菌的整个基因组进行分析，具有区分能力强、重复性好、结果稳定、易于标准化等优点。它为确定菌株之间的亲缘关系提供了可靠的技术手段，被广泛应用于菌种的分子流行病学研究。其操作步骤如下。

a.细菌处理：用灭菌棉拭子取适量细菌悬浮于3ml 细胞悬浮液中，用比浊仪调整细菌的浓度，使其麦氏单位达到4.0～4.2。

b.制备胶块：取200µl 细菌悬浮液于2ml Eppendorf 管中，置于37℃水浴中孵育5min。每管加入20µl 蛋白酶K（储存液浓度为20mg/ml），使其终浓度为0.5mg/ml。加入200µl 已融化并在56℃水浴平衡30min 的1% Seakem Gold 琼脂糖溶液（含1% SDS），用移液器加入胶块制备模具中。

c.细菌裂解：在50ml 的离心管中加入5ml 细胞裂解液，然后再加入25µl 浓度为20mg/ml 的蛋白酶K，使其终浓度为0.1mg/ml。从模具中取出细菌包埋胶块放入离心管中，55℃摇床中孵育2h，摇床转速为170r/min。

d.洗涤胶块：倒掉混合液，加入10ml 50℃预热的超纯水，50℃摇床洗涤10min，洗涤2 次，用TE 缓冲液同样条件洗涤4 次。

e.Xba Ⅰ酶切：在2ml Eppendorf 管中加入200µl 缓冲液，将洗涤过的胶块切成2mm 宽的胶条，放入缓冲液中37℃孵育10min，弃缓冲液，加入200µl 酶切溶液，37℃孵育2h，弃酶切液。加入200µl 0.5×TBE 电泳缓冲液平衡5min。

f.加样：第1、5、10 齿各加1 个标准株H9812 胶块作为Marker，其余齿加样品胶块。将梳子放入胶槽，确保所有的胶块在一条线上。调整齿子高度，使梳齿与胶槽底部接触，缓慢倒入100ml 在55℃水浴平衡0.5h 以上的1%Seakem Gold 琼脂糖溶液。

g.电泳：加2.0～2.2L 0.5×TBE 电泳缓冲液，电泳时间19h，电泳温度14℃，调整初始电流为120～140mA。

h.染色：电泳后将胶放入Gelred 染液（加入1mol/L NaCl）中染色30min，然后用去离子水脱色1h。

i.成像及分析：用凝胶成像仪成像，并将结果用BioNumerics 分析软件进行分析。