大肠埃希菌（Escherichia coli， E.coli）

大肠埃希菌（Escherichia coli， E.coli）

1.形态染色

大肠埃希菌为无芽孢的革兰阴性直杆菌，大小为（0.4～0.7）µm×（2.0～3.0）µm，两端钝圆，散在或成对存在。碱性染料对本菌具有良好的着色性，菌体两端偶尔略深染。运动器官多数为周生鞭毛，一般为1 型菌毛，少数兼具性菌毛，多数具有致病力的菌株还有与毒力相关的菌毛。详见图5-1-1。

2.培养特性

大肠埃希菌为兼性厌氧菌，37℃为最佳生长温度，普通培养基上生长良好，最适宜的环境pH 为7.2～7.4。在麦康凯琼脂培养基上菌落呈红色，在伊红-亚甲蓝琼脂培养基上菌落为黑色且具金属光泽，在SS 琼脂培养基上生长较差或不生长（生长者呈现红色），详见图5-1-2。某些致病性菌株在绵羊血琼脂平板上呈现β 溶血。在营养琼脂上培养24h 后，菌落呈灰白色，直径2～3mm，表面凸起、圆形、湿润、光滑、半透明。S 型菌株在肉汤中培养18～24h，均匀混浊，管底有黏性沉淀，液面管壁有菌环。O157 在显色培养基上培养18～24h，为淡紫色菌落，见图5-1-2（e）。

3.生化反应

本菌能发酵多种碳水化合物而产酸产气。多数菌株可迅速发酵乳糖和山梨醇，极少数迟发酵或不发酵，如O157：H7 菌株不发酵或迟发酵山梨醇。约半数菌株不分解蔗糖。几乎均不产生H2S，不分解尿素。吲哚和甲基红试验均为阳性，V-P 试验和枸橼酸盐（IMViC 试验）利用试验均为阴性。三糖铁上斜面和底层均产酸产气，产H2S 试验阴性。动力培养基生化反应为阳性，尿素（MIU）培养基生化反应为阴性。大肠埃希菌在三糖铁上的生化反应详见图5-1-3。

4.分离鉴定

（1）大肠埃希菌分离鉴定流程：病料接种于血平板和麦康凯平板，37℃培养24～48h。挑取麦康凯平板上的红色菌落或血平板上灰色、圆形、具有特征性气味的典型菌落（有的溶血），分别接种三糖铁（TSI）培养基和普通琼脂斜面做初步生化鉴定和纯培养。将TSI 琼脂反应模式符合埃希菌属的生长物或其相应的普通斜面纯培养物做O 抗原鉴定。大肠埃希菌的分离和鉴定程序详见图5-1-4。

（2）大肠埃希菌血清型鉴定：大肠埃希菌抗原主要有O、K 和H 三种，均为菌体表面抗原。O 抗原是S 型菌的一种耐热菌体抗原，121℃加热2h 不破坏其抗原性。一个菌株含有1 种O 抗原。K 抗原是热不稳定抗原，一个菌株可含1～2 种不同K 抗原，也有无K 抗原的菌株。H 抗原是一类不耐热的鞭毛蛋白抗原，加热至80℃或经乙醇处理后即可破坏其抗原性。每个有动力的菌株仅含有一种H 抗原，且无两相变异。无鞭毛菌株或丢失鞭毛的变种则不含H 抗原。

用大肠埃希菌诊断血清进行玻片或试管凝集试验，鉴定结果可用O ∶K ∶H 排列表示其血清型。如O20 ∶K17（L）∶H19，即表示该菌具有O 抗原20、L 型K 抗原17、H 抗原19。

大肠埃希菌在自然界中可能存在数万种血清型，但致病性大肠埃希菌的血清型数量是有限的。玻片或试管凝集试验鉴定血清型是传统的方法，目前已从致病性或基因水平对大肠埃希菌进行分类。(https://www.daowen.com)

（3）分子生物学鉴定

① 大肠埃希菌毒力因子检测：对病料分离的纯培养物可进行大肠埃希菌毒力因子检测。肠毒素包括不耐热肠毒素（LT）、耐热肠毒素（STa、STb）和志贺毒素（SLT-2e）4 种，黏附素包括K88、K99、987P、F18、F41 等5 种。可用煮沸法提取细菌DNA，肠毒素及黏附素扩增引物序列、退火温度、扩增长度见表5-1-1。

PCR 反应体系。共25µl：Tax remix 12.5µl，上下游引物各0.5µl，模板DNA1µl，灭菌蒸馏水10.5µl。

PCR 扩增条件。肠毒素四重PCR 反应参数：94℃预变性5min；94℃变性45s；54℃退火45s；72℃延伸45s；35 个循环；72℃延伸5min；4℃3min。黏附素PCR 反应参数：94℃预变性3min；94℃变性1min；58℃或65℃（退火温度见表5-1-1）复性45s；72℃延伸1min；35个循环；72℃延伸10min；4℃3min。

② 大肠埃希菌耐药基因检测：大肠埃希菌的耐药基因包括TEM、CTX-M、SHV、OXA，其扩增引物序列、退火温度、扩增长度见表5-1-2。

PCR 反应体系：参考毒力因子检测。

PCR 扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性45s；45s 退火；72℃1min，延伸；30 个循环；72℃10min，延伸；4℃3min。