尿液有形成分自动化分析仪
干化学尿液分析仪对尿液白细胞、红细胞及细菌的检测是依据化学反应而间接得出的定性或半定量结果，很多因素都会导致结果不准确，且不能检出管型、上皮细胞、结晶、寄生虫等。尿有形成分的检验仍以显微镜检验为最准确的方法。但显微镜检验受主观因素影响较多，并且操作繁琐费时，重复性差，难以定量，不容易进行室内质控及标准化，不利于临床动态观察。为此，人们一直在研制能提高临床鉴别能力、具有较高的灵敏度和特异性、并且将尿沉渣分析标准化与自动化融为一体的检验仪器，虽然迄今仍无一台尿沉渣分析仪能完全满足上述要求。但目前应用较为广泛的尿液有形成分分析仪已基本具备程序简化快速、误差小、可定量、重复性好、结果准确、利于进行室内质控及标准化等优点。
全自动尿液有形成分分析仪是集计算机技术、电子技术或高科技光学及影像学技术等各种高科技技术为一体，对尿液中的细胞、管型、结晶、寄生虫、细菌等有形成分进行分析识别、计数定量的专用仪器。
主要有以下两大类：①影像式尿液有形成分分析仪。②流式细胞技术尿液有形成分分析仪。
（一）影像式尿液有形成分分析仪
1.检测原理 为结合流式细胞分析技术和粒子成像分析技术的影像式尿沉渣分析系统。可以直观地对尿液的有形成分如红细胞、白细胞、上皮细胞、管型、酵母菌、细菌和结晶等进行观察，因此与人工显微镜检查原理基本相似，其工作原理为将混匀的尿液注入仪器的标本口，经过自动染色后导入鞘流液内，在仪器平板式流动池中做层流动，在流经显微镜下数码摄像系统时，系统对每个层流经过的有形成分进行摄像，同时计算机进行图像分析，提取尿液有形成分的大小、对比度、形状、质地特征，运用形态识别软件自动识别和分类。由于可以对每个标本的存储图像进行直观的判断，从而减少了手工显微镜的分析过程，但是因尿液中有形成分形态复杂，不能识别的有形成分比例较大，仍需对每份标本逐一识别分类纠正。其主要工作程序为：显微镜+高速摄像+数字相机+图像采集卡+电脑分类软件，人工区分不同类别的颗粒，对可疑成分进行手工复检。
2.检测参数 仪器通过软件将尿液中的粒子区分为12大类型及12类型有形成分的影像。主要包括了12种常见的有形成分的影像参数：红细胞（RBC）、白细胞（WBC）、白细胞簇（WBC clumps）、透明管型（hyaline cast）、非分类的管型（unclassified casts）、鳞状上皮细胞（squamous epithelial cells）、非鳞状上皮细胞（non-squamous epithelial cells）、细菌（bacterium）、酵母样菌（yeast）、结晶体（crystals）、黏液丝（mucus）和精子（sperm）等。
3.方法学评价
（1）优点：可定量、简便快速、无污染、能避免人工显微镜检查由于个体差异所产生的误差，利于进行标准化检测，临床可进行准确量化的动态观察。
（2）缺陷：①尿液过酸、过碱或高低渗以及挤压等情况致细胞变形时，容易产生误认或漏检，含杂质多的标本可致图像模糊，不同结晶难以准确辨认，一些结晶和真菌容易被误认为红细胞。这些因素都可导致假阳性或假阴性结果出现。②需在显示屏上人工区分不同类别的颗粒，对难以确定的有形成分如变形的红细胞、白细胞以及非鳞状上皮细胞、结晶、管型等需要人工显微镜检查确认。
（二）流式细胞技术尿液有形成分分析仪
1.检测原理 流式细胞计数仪原理和电阻抗技术相结合定量检测尿液中的有形成分。（见图2-4）定量吸入的尿液标本经稀释、加温和染色后，依靠液压作用喷射入鞘液流动池。当被检尿液从样品喷嘴出口进入鞘液流动池时，被一种无粒子颗粒鞘液包围，使样品中的每个有形颗粒以单个纵列的形式，沿中心竖轴线依次通过流动池，该单个纵列细胞流快速通过氩激光检测区时，每个细胞均被氩激光光束照射而产生不同程度的荧光强度，荧光强度与细胞和染料的结合程度呈正比。荧光染料含9-氮杂菲和羧化氰，9-氮杂菲能使核酸（DNA、RNA）染色，并与标本中核酸含量有关，以此区别细胞核的有无和多少。羧化氰与细胞的脂质成分结合，其荧光反映细胞的大小。荧光强度与有形成分和染料的结合程度呈正比。
图2-4 全自动尿液有形成分分析仪检测原理简图
荧光强度（fluorescent light intensity，Fl），指从尿液染色细胞发出的荧光，主要反映细胞染色质的强度；前向荧光脉冲宽度（forward fluorescent light intensity width，FLW）主要反映细胞染色质的长度。前向散射光强度（forward scattered light intensity，Fsc）成比例反映细胞大小。前向散射光脉冲宽度（forward scattered light intensity width，Fscw）主要反映细胞的长度。电阻抗信号的大小主要与细胞的体积呈正比，所产生的脉冲信号数相当于细胞数。仪器将捕捉到的前述各荧光信号及电阻抗信号转变成电信号，并对各种信号进行分析，综合识别和计算得到相应细胞的大小、长度、体积和染色质长度等数据，将这些数据转换为每个尿液标本红细胞、白细胞、细菌、结晶、管型等的直方图（histogram）和散点图（scattergram）以及定量报告。
2.仪器组成 主要包括光学检测系统、液压系统、电阻抗系统及电子系统等。
（1）光学系统：由激光反射系统、氩激光、流动池、前向光采集器和前向光检测器组成。采用激光作为光源，经双色反射镜、聚光镜形成射束点，并聚集于流动池的中央。样品中的细胞流经流动池时被激光光束照射，产生前向荧光的光信号。并经双色过滤器区分出前向荧光和前向散射光。光的反射和散射主要与细胞表面相关，散射光强度与细胞的大小相关。
（2）液压系统：液压系统的作用是保证染色细胞排成单个的纵列，逐一通过流动池的中央。鞘液流动机制为通过加压在流动池使鞘液形成一股涡流，使随着真空作用吸入的尿液细胞保持在鞘液中心通过，提高了细胞计数的准确性和重复性。
（3）电阻抗检测系统：当尿液细胞等有形成分通过流动池时，在检测孔电极之间所产生的阻抗使电压发生变化，电压的大小主要与细胞等有形成分的体积相关，形成与细胞等有形成分数量相当，体积大小相应的脉冲电压。从而获得细胞体积和细胞数量的数据。电阻抗检测系统的另一功能是测量尿液的导电率，以得到尿渗量的相关数据信息。
（4）电子系统：将前向散射光、前向荧光等光信号转变为电信号，所有电信号通过波形处理器整理，再传输给微处理器汇总，得出每种细胞的直方图和散射图，通过综合计算分析得出各种细胞数量和细胞形态及种类。
流式细胞技术尿液有形成分分析仪检测信号与功能见表2-35。
表2-35 流式细胞技术尿液有形成分分析仪检测信号与功能
3.检测参数 主要包括尿液有形成分的定量参数，标记参数和Fl-Fsc、Fscw-Flw等散点图信息。
（1）定量参数：红细胞（RBC/μl）、白细胞（WBC/μl）、上皮细胞（epithelial cell，EC/μl）、管型（cast，CAST/μl）、细菌（bacterium，BACT/μl）、导电率（conductivity）。
（2）标记参数（定性）：病理管型（pathologic cast，Path。CAST）、小圆上皮细胞（small round cell，SRC）、类酵母细胞（YLC）、结晶（X-TAL）和精子（sperm，SPERM）。
（3）Fl-Fsc、Fscw-Flw散点图
①红细胞：尿液中典型红细胞直径为8μm，在散点图中分布于红细胞区域。红细胞无细胞核和线粒体，Fl值低，且尿液细胞中红细胞胞体最小，在散点图中接近Fl轴的原点。尿液中的红细胞受机械损伤、渗透压及pH和疾病等的影响大小形态可出现较大变化，因此在散点图中的分布也有很大差异。Fsc和Fscw轴位置较低，有一定变异范围。
流式细胞术尿沉渣分析仪提供的红细胞形态相关信息对鉴别血尿来源具有一定的过筛作用。流式细胞分析技术全自动尿沉渣分析仪可定量报告红细胞量，还可报告均一性和非均一性红细胞百分比、平均红细胞前向荧光强度和分布宽度等参数。肾小球性血尿时较多红细胞变小或成棘形而呈非均一性。在排除了菌尿、尿渗量和pH等可使均一性红细胞向非均一性红细胞转变的情况后，可将非均一红细胞尿作为肾小球性血尿的诊断依据。肾小球性血尿的红细胞形态常表现为不规则形、体积变小或成棘形、圆环状、部分胀大等。图2-5、图2-6、图2-7、图2-8分别为均一、非均一、混合红细胞散点图、直方图和非均一小红细胞散点图、直方图。
图2-5 均一性红细胞
图2-6 非均一性红细胞
图2-7 混合性红细胞
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图2-8 非均一小红细胞
注：尿沉渣仪品牌型号不同Fl-Fsc、Fscw-Flw等散点图信息代表的字母可有不同。
70%红细胞前向散射光强度（RBC-P70Fsc）≤70ch，且红细胞前向散射光强度分布宽度（RBC-Fsc-DW）＞50ch，提示为肾小球性血尿；RBC-P70Fsc≥100ch，且RBC-Fsc-DW≤50ch，提示为非肾小球性血尿；70ch≤RBC-P70Fsc≤100ch，且RBC-Fsc-DW≥50ch，为混合性血尿。
②白细胞：尿液中典型白细胞直径为10μm，稍比红细胞大，核居中。白细胞有胞核，因此白细胞分布于散点图中高荧光强度区。白细胞比红细胞稍大，前向散射光强度也比红细胞稍大一些，能将白细胞与红细胞区别开来，白细胞以高强度的Fl和Fsc的特点出现在散点图的正中央（图2-9）。此外，存活的白细胞呈现出Fsc强和Fl弱的特点，而受损或死亡的白细胞表现为Fsc弱和Fl强。
图2-9 尿液中白细胞
③细菌：体积小但含有DNA和RNA，所以前向散射光强度（FSC）较红细胞和白细胞弱，特别是球菌仅能被高灵敏细菌模式（H-Bacterial）检测到。荧光强度（Fl）较红细胞强，较白细胞弱，出现在Fl-Fsc及Fscw-Fl散点图中红细胞和白细胞之间的下方区域。由于死细菌的染色灵敏度较活细菌强，所以死亡细菌所产生的荧光强度较强。
④上皮细胞：上皮细胞种类较多且大小不等，并且都含有细胞核和线粒体，荧光强度较强，通常大的鳞状上皮细胞和移形上皮细胞分布在Fscw和Flw为参数的散点图左上角。
⑤管型：出现在Fscw和Flw散点图中，透明管型由于管型体积大但无内容物，有极强的前向散射光脉冲宽度（Fscw）和微弱的前向荧光脉冲宽度（Flw）；出现在第二个散射图的中下区域。病理管型体积与透明管型相似，但因有白细胞、上皮细胞等含线粒体和细胞核的内容物，有极高的Fscw和Flw，荧光信号强。出现在第二个散射图的中上区域，仪器根据荧光强度和脉冲宽度可识别透明管型和病理管型，并报告具体数量。由于管型的种类较多且形态各异，仪器难以分辨管型的性质，只能区分出透明管型和病理管型。此外、黏液丝、棉毛、麻纤维等类管型异物可引起假阳性；有些管型短而小，易被仪器漏检而产生假阴性结果。
⑥真菌和精子：分布在Fl-Fsc散点图中，真菌和精子细胞都含有核酸（RNA和DNA），具有很高的荧光强度（Fl），因为二者的前向散射光强度（Fsc）与红细胞和白细胞相差不多，故分布区域位于红细胞、白细胞之间。精子比酵母菌染色更灵敏，酵母菌的前向散射光脉冲宽度（Fscw）小于精子细胞脉冲宽度，借此区别酵母细胞和精子细胞。但在低浓度时，区分精子细胞与酵母细胞有一定的难度。而在高浓度时，真菌的Fsc与红细胞相似，分布在Fl-Fsc散点图中。这部分酵母菌会对红细胞计数产生干扰。
⑦结晶：分布在散点图Fsc和Fl的红细胞区域，结晶在染色过程中不着色，其Fl较红细胞更低。由于结晶的多样性，前向散射光强度（Fsc）随结晶的大小相应变化，其散射光强度分布很宽。草酸钙的分布区域在贴近Y轴的Fsc、Fl散点图中；尿酸盐结晶在散点图中的分布与红细胞散点有重叠。结晶的中心分布不稳定，以此区分红细胞和结晶。需要注意的是当尿酸盐浓度增高时，部分结晶会对红细胞计数产生干扰。此外，仪器不能准确区分各种结晶，当仪器显示有结晶标记时，应按尿沉渣手工检查方法离心尿液，显微镜下仔细观察是何种结晶。
（4）导电率：导电率代表总粒子中带电荷的部分，尿渗量代表溶液中溶质的质点数量。因此导电率与反映尿液中粒子总数量的尿渗量既相关又有差别，例如尿糖时因葡萄糖非电解质不带电荷，尿渗量高而电导率无相应增加。
（5）其他信息：除以上信息外，仪器还提供非溶血性红细胞数量和百分率（Non-lysed RBC，Non-lysed RBC%）、红细胞平均荧光强度（RBC-MFl）、红细胞平均散射光强度（RBC-MFsc）和红细胞荧光强度分布宽度标准差（RBC-Fl-DWSD）、白细胞平均前向散射光强度（WBC-MFsc）、尿沉渣总颗粒数、细菌总颗粒数等信息。
4.临床意义
（1）红细胞：尿液红细胞数量及红细胞与白细胞的比例有助于血尿相关疾病的诊断和鉴别诊断；观测红细胞数量的动态变化有助于疗效观察和预后判断；红细胞形态信息对鉴别血尿的来源具有重要价值，非均一性血尿可作为肾小球源性血尿的重要依据。但应注意排除如下影响因素：①结晶、细菌、真菌增多时，其参数结果与红细胞参数相重叠，可误计为红细胞，以草酸钙结晶最常见。②如血尿同时存在菌尿、尿渗量过高或过低、尿液过酸或过碱以及放置时间过长等情况时，非均一性血尿可能是由于上述原因所致。
（2）白细胞：观察尿液中白细胞数量有助于泌尿系统感染等疾病的诊断，其数量的动态变化有助于疗效观察；仪器提示的白细胞高活性和低活性的不同比例有助于急慢性感染以及恢复期的判断。需注意大量上皮细胞、真菌、滴虫、脂肪滴等可使尿液白细胞计数不同程度地增高。
（3）细菌：尿液白细胞增多伴随大量细菌通常提示泌尿系统感染，将白细胞和细菌的检测信息进行综合分析对诊断泌尿系统感染有重要价值。对是否需要细菌培养也有一定的筛选作用。仪器对细菌有较好的分辨率及较高的精度，可检测出微小细菌如大肠埃希菌等，对是否需要细菌培养有一定的筛选作用。
（4）上皮细胞：少量鳞状上皮细胞和移行上皮细胞可见于正常人尿液，但当这两种细胞增多，或前两细胞增多并可见小圆上皮细胞时，提示存在泌尿系统炎症。尿沉渣分析仪能报告上皮细胞的定量结果，并标示小圆上皮细胞。小圆上皮细胞包括肾小管上皮细胞、中层和底层移行上皮细胞。这些细胞的大小与白细胞相近、形态较圆，因这些细胞散射光、荧光及电阻抗的信号变化较大，仪器不能准确区分是哪一类细胞。但这类上皮细胞多为病理性的，当仪器提示这类细胞达到一定数量时，应按尿沉渣手工检查方法离心尿液，显微镜镜检进行准确分类。需注意当尿液中有大量白细胞、滴虫等时，因检测参数与上皮细胞重叠，可导致上皮细胞计数显著增高。
（5）管型：极少量透明管型可见于正常人尿液，若大量出现提示肾实质损害。需注意仪器只起过筛作用，筛检出透明管型和病理管型的存在，当仪器提示有病理性管型时，需按尿沉渣手工检查方法离心尿液显微镜确认是哪一类管型。
（6）导电率：对糖尿病、尿崩症的鉴别诊断有重要价值。此外，尿液长期高导电率者，可能存在大量易形成结石的电解质，应警惕结石的发生。
各检测参数分布区域及特性见表2-36。
表2-36 各检测参数分布区域及特性
5.方法学评价
（1）优点：快速、采集的信息量大，当检测标本体积为9.0μl时，相当于显微镜检测50个高倍视野，检测总粒子范围为0～40000。操作简便、尿液中常见的有形成分都有相应的参数，将定量结果和相应的散点图、直方图进行综合分析，可提高对疾病的诊断水平，能对临床提供更为准确的尿有形成分信息。
（2）缺陷：不能对各种有形成分进行形态的准确辨认，形态、大小相近的各种不同的有形成分可能会因在分布区域的重叠或计数的错误导致假阴性或假阳性结果。
影像式尿沉渣分析仪和流式细胞术沉渣分析仪都具备以下共同优势：①不需要离心尿液，可自动进样，污染小。②简便快速、每小时可检测40～100个标本，一次检测可报告多个参数，可定量，方便动态观察。③方法程序统一，易于标准化和质量控制。④采集的信息量大，计数每份标本的细胞数量明显高于手工显微镜检验，并能避免人工镜检个体差异所产生的误差。具有手工操作无法比拟的重复精度。两种方法又都有各自的特点，详见表2-37。
表2-37 影像式尿沉渣分析仪和流式细胞术尿沉渣分析仪特点比较
目前，临床常用的自动化尿沉渣分析仪，不论是影像式尿沉渣分析仪还是流式细胞术尿沉渣分析仪通常都与尿干化学分析仪共同组成一个分析系统。因为由于方法学的不同，自动化尿沉渣分析仪和尿干化学分析仪分别具备不同的技术特点：①尿干化学分析仪可检测尿液的比重、酸碱度、酮体、葡萄糖等理化内容并且较为准确；尿沉渣分析仪对尿液红、白细胞的检测较为准确，还可检测管型、结晶、精子及上皮细胞等更多的尿液有形成分并可定量。②干化学法检测白细胞实际是检测中性粒细胞。当尿液中所含的白细胞是淋巴细胞和单核细胞时则为阴性。尿沉渣分析仪可对尿液中所有的白细胞进行检测，弥补了尿液干化学法只对粒细胞反应，而与淋巴细胞和单核细胞不反应的不足。③尿液沉渣分析仪不仅能检出不含硝酸盐还原酶的细菌，而且能对细菌含量进行定量。④干化学法隐血检查结果与尿液沉渣分析仪红细胞散点图和直方图以及计数结果综合分析，可判断出血状况和性质。
尿沉渣分析仪与尿液干化学分析仪联合检测可以发挥各自的优势和相互弥补不足，提高检测的准确性。其报告单为尿沉渣分析参数检验和干化学分析参数检验以及人工显微镜检查结果的整合，能够为临床提供更为完整的尿液分析信息。
6.质量保证
（1）分析前：①患者留取尿液准备和收集保存尿液标本要求同尿液一般检查部分。②依据制定的SOP文件按规定进行仪器的保养、校准和性能验证。③检查仪器是否处于正常工作状态，每日开机必须进行室内质控，质控合格方可开始患者的标本检测。
（2）分析中：①核对与样本相关的各种信息，及时准确上样。②当仪器出现复查信号时，如计数、分类、电导率异常，提示检测结果可信度低。需检查排除干扰因素。③仪器操作人员必须熟悉各检测参数的干扰因素，尽可能给予排除或识别可疑、假阴性、假阳性结果并通过手工复检纠正。
（3）分析后：①再次核对各相关信息是否正确录入。②注意干化学检查与尿沉渣检查结果之间的关联性，两种检查是否存在相互矛盾的结果，复核确认检验结果。③当临床诊断和检验结果不相符合时，需复查有疑问的标本，必要时重新采集标本检验，并与临床进行沟通。