二、原理
(一)细胞周期(cell cycle)
细胞周期是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程,分为间期与分裂期两个阶段(图9-8)。在这一过程中,细胞的遗传物质复制并均等地分配给两个子细胞。间期又细分为三期:即DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)与DNA合成后期(G2期)。
图9-8 细胞周期
1.G1期(first gap) 从有丝分裂到DNA复制前的一段时期,又称合成前期,一般持续时间在10 h左右,此期主要合成RNA和核糖体。该期特点是物质代谢活跃,细胞体积显著增大,但核内染色体数量无改变,均为23对染色体。
2.S期(synthesis) 即DNA合成期,一般持续时间在9 h左右,在此期,主要完成DNA染色体的合成复制,同时还要合成组蛋白。此时期内染色体数量会由23对过渡至46对。
3.G2期(second gap) 即DNA合成后期,一般持续时间在4 h左右,是有丝分裂前的最后一个时期。在这一时期,DNA合成终止,染色体数量保持在46对。
分裂期,即M期,一般持续时间在1 h左右,是整个细胞周期中最短的一个环节,由一个母细胞分裂成为两个子细胞。46对染色体会平均分配至两个子细胞内,各含有23对染色体。
在一个增殖的细胞群中,所有细胞并非是同步增殖的,它们在细胞周期运行中,可能有4种命运:①细胞经M期又开始第2次周期;②停止于G2期,称为G2期细胞(R2),它受某种刺激后可进入周期;③停止在G1期,称为休止细胞或G0期细胞,这类细胞受某种刺激后仍能进入周期,继续进行有丝分裂,正常情况下,机体内超过90%以上的细胞处在这个时期;④丧失生命力近于死亡的细胞,称为丢失细胞,或称不再分裂的细胞。继续分裂的细胞沿着细胞周期从一个有丝分裂期到下一个分裂期。不再分裂的细胞离开了细胞周期不再分裂,最终死亡。
(二)DNA指数
正常二倍体细胞核内DNA含量基本恒定,23对染色体约7.18pg,目前常用的单位包括倍体(content)及DNA指数(DNA index,DI)。在进行DNA定量分析时,并不直接测定细胞核内的DNA含量,而是利用系统测量到的染色细胞核的积分光密度(integrated optical density,IOD)来判断细胞核内DNA的含量。(https://www.daowen.com)
如果测量的细胞刚好处于G0/G1期,其IOD的含量就与正常参照细胞的IOD平均值很接近,故计算出来的DI值就在1的附近。而正常情况下,机体内大部分细胞均处于这个时期,所以计算出来的大部分细胞核DI值会集中在1的附近。如果被测量的细胞处于G2期,其核内染色体组数为46对,即4倍体细胞,为正常二倍体细胞的两倍,故计算出来的DI值就在2的附近。处于S期的细胞,DI值的范围在1～2。
DI值是一个相对的比值,而不是一个DNA含量的绝对数值,所以它是没有单位的。而软件选择作为参照的正常细胞,部分软件会选择细胞核形态及核内DNA含量相对稳定的固缩核细胞,部分软件会选择根据参数优化出来的样本本身的二倍体细胞对为参照。
(三)检测系统
目前国内外使用的DNA倍体检测系统有很多,但基本都由几个大块构成,在肿瘤早期诊断中显示了明显的优势。现在市场上广泛使用的生物显微镜主要是根据光学成像原理设计的,把光学显微镜加上CCD自动摄像即可以实现对细胞图像的全自动采集,通过对采集图像的识别和分类,即可实现上述目标(图9-9)。
图9-9 DNA倍体检测仪
(四)质量控制
DNA倍体检测作为自动化检测设备,其质控是非常有必要的,通常会影响到其检测的DNA含量,主要包括以下两个方面:被检测的玻片的染色的稳定性和检测设备的稳定性,可以选择如下方式进行质量的管控。
1.染色的稳定性 软件对检测样本扫描分类完成后,会基于分类得到的二倍体正常细胞计算一个IOD平均数值,根据不同的设备和软件,会有标准的IOD数值的范围,记录同批次染色完成的玻片IOD数值,观察是否均在要求的数值范围内,可以用于评估染色的稳定性。如果均在数值范围内,则证明该批次染色相对稳定;如大部分样本检测得到的IOD数值均高于或低于设定的阈值,则染色效果不佳,稳定性较差;如仅有少量样本不在数值范围内,经重复制片染色后,数值均不能达到正常范围,则考虑样本的问题,如保存液固定是否合格、样本内是否混入了其他外源性杂质。
2.检测设备的稳定性 作为基于光密度原理使用的自动化显微镜,对于整体显微镜的光源稳定性和整个照明系统的稳定性要求非常高,所以需要定期来检测确认检测设备是否稳定。可以选择使用标准玻片对设备重复扫描,观察设备的稳定性。频次根据实验室环境及设备使用时限,可选择每周1次至每月1次。检测之前,需要对设备进行显微镜科勒照明系统进行调整,保障照明系统标准化,然后将标准玻片进行扫描,扫描完成后,观察二倍体细胞的DI值、IOD值、CV值及分析细胞总数是否在范围内来评估设备的稳定性:①每次扫描完成后,相同二倍体细胞图像的DI值偏差＜10%;②二倍体细胞平均IOD值偏差＜10%;③二倍体细胞CV值偏差＜10%;④分析细胞总数偏差＜10%。