三、检测技术
要保障DNA倍体检测结果的准确性,前期的制片染色流程非常关键,必须严格地按照相关操作的标准流程来进行,才能保证制片染色的标准化及准确性。
(一)制片
目前国内常见的细胞学制片方式包括手工涂片、直接甩片、膜式液基薄层制片术(TCT)、比重离心沉降式制片术(LCT)等方式。手工涂片速度快,但需要及时的固定,否则细胞容易退变,影响DNA含量的检测,同时对于涂片的医生要求高,区域范围不固定,很容易出现涂片厚薄不均匀导致检测结果不准确,目前实际使用较少。直接甩片的区域范围相对固定,制片速度较快,制片孔径多集中在15～20 mm直径范围,但对于黏液、血液、炎性样本前处理少,制片效果一般。TCT技术进入国内较早,制片速度快,可单张制片,制片孔径为约18 mm的圆形区域,样本有预处理,制片效果佳。LCT制片技术进入相对较晚,批量制片,为13 mm直径的圆形区域,较TCT小,制片密度均匀,阳性细胞收集更为集中。
(二)Feulgen染色
为了更精准地进行DNA倍体的定量检测,检测的样本通常会选择使用Feulgen染色的方法来进行细胞核内DNA的染色。DNA-Feulgen染色方法由Feulgen等人在1924年建立,这种方法至今仍然是DNA定量测定的主要染色方法之一。其作用机制也久经研究和讨论,现已取得一致意见。其具体反应原理是,标本经稀盐酸水解后,DNA分子中的嘌呤碱基被解离,从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应,形成含有醌基的化合物分子,因醌基为发色团,故可呈现出紫红色。也就是说,DNA经稀盐酸水解后产生的醛基具有还原作用,可与无色品红结合形成紫红色化合物(图9-10),故Schiff试剂与DNA上暴露出来的醛基是一个定量的结合,其显色的深浅与核内DNA的含量呈正相关,从而可以显示出DNA的含量及分布情况。与Schiff试剂具有相同功能的还有硫堇试剂,不同的是硫堇试剂本身就具有颜色,且染色后细胞核实际显色效果为紫蓝色,更贴近苏木素的细胞核染色,同时具有显色颜色深、不易褪色的优势,所以目前进行DNA倍体检测多会选择硫堇染色。
图9-10 Feulgen染色原理
Feulgen染色的方法流程比较多,选择一种进行介绍:①切片置于95%酒精固定30 min;②流水洗涤4～5次;③固定液固定60 min;④流水洗涤4～5次;⑤分化液分化45 min[温度(25±2)℃];⑥流水洗涤4～5次;⑦置于染液中染色60 min[温度(25±2)℃];⑧流水洗涤4～5次,洗涤完成后在水中浸泡5～10 min;⑨酒精中梯度脱水,封片。
(三)染色影响
Feulgen染色的流程中,很多因素均可影响到染色的效果,如实验室的温度、湿度、试剂的浓度、p H值等,但主要影响的还是固定、分化及染色的过程,下面分别对几种影响的因素进行说明。
1.固定 样本在分化前必须经过固定,固定液可以更好地固定细胞核,确保胞核面积大小在后续分化的过程中不会受到影响,同时可以固定核内DNA,使得核内DNA不会在水解的过程中丢失,从而影响核内DNA含量的测定(图9-11、图9-12)。
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图9-11 固定前
图9-12 固定后
2.分化 从前面的Feulgen染色原理中可以了解到,硫堇染色液之所以可以与核内DNA结合染色,是因为硫堇染色液与醛基结合显色,而醛基的产生则来源于分化。利用盐酸将DNA螺旋结构上的脱氧核糖核苷酸与碱基分开,水解成为含有醛基的核苷酸,从而与硫堇染色液相互结合显色。如果分化不充分,则醛基暴露不充分,显色后测量得到的IOD数值则偏低,随着分化程度的增加,IOD数值会随之增加。但如果分化过度,DNA分子在酸性水解的过程中会被裂解成小片段,这些小片段会在后续水洗的过程中脱落,也会造成IOD数值偏低。同时温度也会影响整个分化的过程,温度越高,分化速度越快,分化时间越短,温度越低,分化速度越慢,分化时间越长。在高温下分化,虽然时间短,但曲线平台期短,人工操作时很难控制,故适合于机械自动化染色。选择人工操作染色时,依然建议选择室温下分化,平台期长,染色稳定性好(图9-13)。
图9-13 温度及HCl的影响
3.硫堇染色 在Feulgen染色的过程中,分化后得到的脱氧核糖乙醛结构是一个不稳定的结构式,它和脱氧核糖半缩醛是一个可逆的过程,所以硫堇染色液与醛基结合并显色的过程也是一个缓慢进行的过程,也会有一个IOD数值逐步上升并到达一个平台期的过程(图9-14)。所以在硫堇染色的过程中一定要保证整体染色的时间达到标准所要求的时间,同时注意不要让固定液污染到硫堇染色液内,因为其内含有醛基,会造成硫堇染色液染色效果降低。
图9-14 染色时间
4.水洗 作为Feulgen染色的最后一个流程,硫堇完成后需要一个水洗浸泡的过程,这一步的目的是去除掉一些非特异性的硫堇着色。因DNA双螺旋结构的特征性,容易发生嵌入式的非特异性染色(图9-15),通过水洗和浸泡可以去除这种非特异性染色。水洗浸泡的时间通常是15～30 min,流水缓慢洗涤的效果优于浸泡,温水效果优于冷水,特别是在室温过低的情况下,直接使用冷水水洗浸泡,可能会导致硫堇染液析出硫堇结晶,直接影响DNA倍体检测。
图9-15 嵌入式染色