卵细胞质内单精子注射
一、适应证与禁忌证
(一)适应证
目前尚无完全统一的适应证标准。必须明确的是,卵细胞质内单精子注射(ICSI)系一种侵入性操作,其治疗不孕症的确切机制和潜在风险目前实际并未阐明,且治疗费用高,不能也不应取代常规IVF,因此,ICSI开展需要掌握好适应证。ICSI的适应证如下。
1.严重的少精子症、弱精子症、畸形精子症
ICSI仅需数条精子即可达到受精、妊娠的目的,是严重男性因素不育患者最有效的治疗方法。目前暂未统一明确的ICSI治疗标准,但普遍认为下列情况需要ICSI辅助受精治疗:①严重少精子症患者,即一次射出的精液中精子浓度≤5×106/ml;②一次射出的精液中精子浓度在5×106/ml～20×106/ml,活动率＜40%,或Ⅱ级以上运动精子＜25%,或畸形精子率＞85%;③一次射出的精液中精子浓度≥20×106/ml,但严格标准的精子形态学检查示精子正常率＜4%,或精子活动率＜5%。
2.不可逆的梗阻性无精子症和生精功能障碍(排除遗传缺陷疾病所致)
如附睾或睾丸手术获得数目很少或活力很差的精子,可用ICSI辅助受精。早期采用的是显微附睾精子抽吸,由于显微附睾手术耗时长、手术难度大、对患者损伤大,现多采用经皮附睾穿刺抽吸取精术。当附睾缺如或完全机化时,可从睾丸取出的曲细精管中分离精子,进行ICSI。近年来也采用睾丸曲细精管精子或精子细胞进行ICSI,以治疗严重生精功能低下所致的非阻塞性不育。
3.体外受精失败
①前次IVF不受精:Cohen等发现完全受精失败的患者,再次IVF的受精率不会超过25%。而Palermo等给前次IVF受精率＜25%的患者使用ICSI再次治疗,则获得较高的妊娠率。目前一般认为如前次IVF受精率＜50%,再次治疗应采用ICSI技术。②IVF不受精卵:对IVF中未受精的成熟卵子,可于IVF次日补行ICSI,获得正常受精和形态正常的胚胎。这种补救方法称为晚补救,因其卵裂率、囊胚形成率、植入率和妊娠率低下,现在应用较少。其原因不在于ICSI本身,而是因为卵子老化。目前在国内临床应用更多的是早补救,即在取卵当日对未受精卵子进行ICSI。具体而言,IVF受精4～6 h,通过去卵丘细胞观察卵子第二极体的排出以确定卵子是否受精,若在IVF后6 h仍未排出第二极体的卵子达到一定的比例(比如大于50%的获卵数),则行ICSI以进行补救。目前的观点为早补救是防止卵子受精失败或受精率低的有效措施,早补救的卵子可获得与正常卵子相似的受精率和妊娠率。
4.精子顶体异常
包括圆头(顶体缺乏)精子或完全不活动精子。ICSI是圆头精子症患者唯一可以采用的治疗方法,但是较低的受精率表明这些精子没有足够的能力激活卵子,常常需与卵子激活结合应用。现有的证据表明这些精子的使用并不增加流产率或非整倍体及出生缺陷。对于不活动精子,可通过低渗试验选择活精子或直接应用其睾丸精子进行ICSI,有助于提高受精率。
5.冻存卵子或体外培养成熟后的不成熟卵子
成熟卵子冻存复苏后或不成熟卵子经体外培养成熟后,其透明带变硬使精子不易穿透。为保障受精,建议行ICSI。
6.需行植入前胚胎遗传学检查
为避免透明带上黏附精子对诊断结果有影响,植入前遗传学诊断通常采用ICSI。
(二)禁忌证
(1)男女任何一方患有严重的精神疾患、泌尿生殖系统急性感染、性传播疾病。
(2)患有《中华人民共和国母婴保健法》规定的不宜生育的、目前无法进行胚胎植入前遗传学诊断的遗传性疾病。
(3)男女任何一方具有吸毒等严重不良嗜好。
(4)男女任何一方接触致畸量的射线、毒物、药品并处于作用期。
(5)女方子宫不具备妊娠功能或严重躯体疾病不能承受妊娠。
二、ICSI程序步骤
一般程序步骤包括:控制超促排卵,促进多个卵泡发育;卵母细胞获取;精子的收集和处理;显微注射;胚胎体外培养和移植。
三、精子的收集和处理
对于梗阻性无精子症,既往采用显微外科输精管附睾吻合术、经尿道射精管切开术等方法治疗,成功率低、治疗效果差。采用手术显露直视下穿刺附睾、附睾切开取精的方法,创伤大、并发症多,且不能反复进行。经皮穿刺输精管、附睾、睾丸吸取精子的成功,使取精技术取得重大进展,该方法损伤轻微、操作简便,术后不易产生粘连、瘢痕等并发症,并可反复进行穿刺,取得较多精子,效果良好。对输精管盆部阻塞或性功能障碍所致不射精或逆行射精的患者,采用经皮穿刺输精管精子抽吸术,所获得的较好质量精子可用于子宫腔内人工授精(IUI),妊娠成功率较高,手术费用较低;当吸出的精子质量较差时,应当进行ICSI辅助授精。
经皮穿刺输精管、附睾、睾丸吸取精子后,进行ICSI辅助授精,在治疗不育上获得了成功,使不同来源的精子均能取得较好的受精率、卵裂率及妊娠率,与射出精子所获得的受精率、卵裂率及妊娠率无明显差别。
(一)精子收集前诊断要点
为了收集到可供受精的精子,精子收集前应认真进行诊断与鉴别诊断。
(1)重点了解影响睾丸生精功能的相关病因。
(2)检查病变部位特征,尤其注意睾丸大小。若睾丸＜8 ml,第二性征发育有异常,应随即检查染色体有无异常;若睾丸≥10 ml,不射精或精液量少,应注意有无射精功能障碍,是否为严重少精子症,应重复检查精液,或行性高潮后尿液检查,必要时做睾丸功能检查。精液量少、精子活力差,有可能是精道部分阻塞。
(3)FSH水平对鉴别梗阻性无精子症和非梗阻性无精子症有一定意义,非梗阻性无精子症的FSH值增高。若FSH值明显增高,多有生精障碍。
(4)对于非梗阻性无精子症或严重少精子症,应做染色体分析、Y染色体微缺失分析。对先天性输精管缺如或特发性附睾梗阻的无精子症,应检查有无囊性纤维化基因变异。
(5)对于精囊及输精管缺如,应进一步了解睾丸生精功能。有生精功能者,为输出道梗阻,异常者可能为唯支持细胞综合征或生精阻滞。
(6)睾丸活检主要了解无精子症是睾丸输出道梗阻所致,还是生精功能障碍所致的。一般只做一侧检查,有些情况需做两侧,如精索静脉曲张不育症、隐睾等。
(二)经皮穿刺输精管精子抽吸术
适应证包括:①输精管远端阻塞、输精管绝育术后复通术失败、射精管阻塞;②阴茎勃起功能障碍、不射精等功能性障碍,经其他治疗失败,睾丸生精功能良好;③逆行射精功能性障碍,若取自膀胱尿中逆行射精的精子质量差,影响受精效果。
(三)经皮穿刺附睾精子抽吸术
1988年Silher等利用显微手术从先天性输精管缺如的无精子症患者的附睾头部吸取精子,进行IVF-ET并成功妊娠,但由于从附睾吸取的精子数量少、动力差,致使受精率甚低,不宜用于IVF-ET。1992年Palermo等将单精子注射到卵细胞质内辅助受精成功后,随后应用经皮穿刺附睾精子抽吸术行ICSI,获得较高的受精率,近年已成为治疗无精子症的有效方法。(https://www.daowen.com)
适应证包括:①先天性输精管缺如、炎症性输精管阻塞;②附睾体部、尾部发育不全或缺如,或炎症性病变造成阻塞;③输精管结扎术后吻合失败造成附睾尾部粘连阻塞。
(四)经皮穿刺睾丸精子抽吸术
经皮穿刺睾丸精子抽吸术可吸取到生精细胞、各期精子细胞、精子及支持细胞,操作简便,对睾丸损伤轻微。睾丸精子、精子细胞均可应用于ICSI,获得成功妊娠。睾丸穿刺吸取液还可进行细胞学检查,以精子比率(精子与所检各类生殖细胞的比例)和支持细胞比率(支持细胞与各类生殖细胞的比例)作为推断睾丸生精功能的指标。用于活检,诊断迅速,其诊断结果与常规活检的结果基本一致。
适应证包括:①睾丸性无精子症如精索静脉曲张、睾丸炎、睾丸损伤、隐睾等原因导致的睾丸生精功能低下,常规检查无精子,但睾丸活检曲细精管内有成熟精子;②附睾穿刺吸取精子不成功者。
(五)开放手术睾丸精子提取术
当经皮穿刺睾丸精子抽吸术不成功时,可用钳穿活检。用组织钳刺入阴囊,穿刺白膜,进入睾丸实质5 mm,钳取数条曲细精管,分离精子。
(六)睾丸显微取精术
非梗阻性无精子症患者不存在输精管梗阻,表现为无精子生成或生成极少。国内外大量的活检结果表明,非梗阻性无精子症患者的睾丸内仍然可能存在生精现象,表现为少量的局灶生精。如果在活检过程中提取到这些有生精活性的组织就可能发现精子。睾丸显微取精的方法为麻醉后在睾丸表面无血管区沿睾丸赤道面切开白膜,手术显微镜放大20～25倍,寻找外观饱满、乳白色、半透明或不透明、相对粗大并有张力的生精小管,并剪下,在体视镜下撕碎后,于倒置显微镜下(400×)查找精子。传统的睾丸切开活检、经皮穿刺都属于非选择性的随机组织活检,对于局灶生精的病例难以命中微量的生精组织。睾丸显微取精术通过对生精组织的辨别,减少了活检取样的盲目性,手术损伤小,也避免了睾丸组织不必要的丢失,相比传统的切开活检或穿刺活检能提高8%～25%的获精率,能使常规睾丸活检方法无法获取精子的患者得到生育亲缘后代的机会。总体而言,非梗阻性无精子症的获精率在20%～60%,适用于克氏综合征、睾丸严重发育不良或睾丸炎后睾丸萎缩的病例。
四、精子的准备
1.射出精液
常规检查精子浓度、活动度、精子形态。对少精子、弱精子、冻融精子采用合适的精子分离方法分离待用。
2.输精管穿刺取精和附睾穿刺取精
将混有培养液的精液或附睾液注入培养皿中,加入2～3 ml M-HTF培养液,置入37℃恒温水浴箱中孵育活化40～60 min,离心200 g,5 min,沉淀待用。
3.睾丸取精
先将曲细精管放入盛有培养液的培养皿中,吹打洗涤干净后,将曲细精管用细小的弯头镊子磨碎或用注射器针头撕碎,去除大的组织,将此悬液吸入预热的精子洗涤液中,直接离心,留取沉淀备用。来自睾丸的精子中,只有很少是活动的,活动精子大多也仅仅偶尔颤动,因此,存活精子的判断非常重要。有研究显示对于睾丸组织来源的精子,无论是新鲜的睾丸组织还是冷冻的,进行ICSI的最佳时间是睾丸组织培养24～48 h,活动精子的比率会大大提高,从而提高ICSI的受精率,改善治疗结局。因此可以将睾丸活检或显微取精安排在取卵前1～2 d进行,以便得到更多的活动精子,进行ICSI。
五、卵子收集和准备
成功控制超促排卵后,采用经阴道B超引导下穿刺取卵。取卵后2 h,将卵母细胞置于含80 IU/ml透明质酸酶的M-HTF中,用巴斯德管在立体显微镜下吹打。观其卵丘细胞大部分脱去后移至准备好的另一新的M-HTF清洗孔中,去除剩余的卵丘细胞和放射冠细胞。将得到的裸卵在新的M-HTF中清洗2次后,在显微镜下检查卵子的成熟度,只有MⅡ成熟的卵母细胞能行ICSI,MⅠ和GV期的需要体外培养成熟到MⅡ才能进行ICSI辅助受精。
六、ICSI操作步骤
(1)将注射针降低,放入干净的聚乙烯基吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidome,PVP)液中,旋转控制注射器的微调,调试注射针液体的进出速度。
(2)再将注射针放入含精子的PVP液中,挑选形态正常的活精子,吸入注射针内,移至干净的PVP液中,在其尾部中段慢慢下压,随即将针快速拉过精子尾部,将其制动(一般以明显可见的尾部折痕为宜)。然后再将精子从尾部吸入注射针,抬高注射针。
(3)移针至含卵子的液中,用固定针将MⅡ期卵母细胞通过负压轻轻固定,第一极体在12或6点处,避免注射过程对卵母细胞纺锤体的损伤。
(4)注射时先将精子移到注射针内口处,调整注射针、固定针内口及卵膜在同一水平后进针,穿过透明带后继续进针,同时不断调整平面,可以看到卵膜随注射针的顶入弹性伸展进入卵浆中,这时不要将精子注入卵膜形成的陷窝内,否则精子只是被注射到透明带下。穿刺卵膜近卵子中间时,可见卵浆回弹包住注射针或注射针有明显的落空感,表明刺穿了卵膜,偶尔也见到尽管注射针已刺入接近9点处的卵膜,但仍未刺穿卵膜,可能是卵母细胞胞浆张力不够的原因,这时可稍稍回抽针尖,调准平面后再较快速进针,可刺穿卵膜。
(5)回吸少量卵浆,当卵浆开始快速吸入注射针时,表明卵膜已有破裂口,立即停止回吸,转而注入吸出的卵浆及精子,再迅速出针,尽可能少地注入PVP液。注射完毕,观察卵膜回复正常位置,并观察精子注入的部位是否随卵膜的回复而至卵膜外、注入PVP的量及是否有卵浆的外漏、卵子的损伤。
(6)释放经注射的卵子,移走固定针。将穿刺针移至PVP平衡液中吸吹数次,清洗注射针。
(7)重复(2)～(6),完成对其他卵细胞的操作。
(8)用HTF将注射完毕的卵细胞清洗数次,将每个卵细胞移入HTF微滴中,置入CO2培养箱内培养。完成有关操作记录。
七、影响ICSI治疗的因素
1.精子因素
临床研究发现,在ICSI治疗周期,尽管精液中可能无形态正常精子,或无活动精子,但仍有可能完成受精并成功妊娠,关键在于能否发现存活精子。尽管精子形态学异常等多项异常均可不同程度地影响ICSI的结局,但真正能够导致ICSI受精失败的精液指标是精子活动率为0,当无活动精子发现时,存活精子的存在概率大大降低,将严重影响ICSI的受精过程。
2.女方因素
女方年龄不影响受精率,但妊娠率随年龄增长而降低,当女方超过40岁时,活产率显著降低。通常随年龄增长的种植率降低是卵子质量下降引起的,与子宫内膜关系不大。此外,部分患者的IVF失败,实际由卵母细胞内在异常所致,此类患者改用ICSI治疗仍然无效。
3.卵子的激活
卵子自然受精的激活发生在精子与卵子特异性受体结合、穿透卵膜及精卵融合过程。ICSI无此自然激活过程。有报告显示显微注射过程的猛烈来回抽吸卵浆有助于卵子激活,提高ICSI受精率与妊娠率。但也有研究认为,猛烈来回抽吸卵浆无助于提高受精率,却易损伤卵子结构,不利于卵子的进一步发育。而在显微注射前猛烈地制动精子,从而损伤精子尾部,增加精子膜渗透性,也可提高ICSI的受精率。但Palemo等的研究表明猛烈制动对射出精子ICSI的受精率实际影响不大,但对附睾精子的受精率可从51%提高到84%,妊娠率也有所增加。制动损伤精子膜从而增加受精率的机制,可能与有利于卵浆内有关激活因子的渗入,从而激活精子、诱导雄性原核形成有关。至于附睾精子、睾丸精子的猛烈制动,可能还涉及其中精子成熟抑制因子的释放。
4.卵子结构的破坏
显微注射损伤卵子结构,最终可能发生卵子死亡。损伤可由注射针对卵母细胞膜性结构、超微结构和减数分裂纺锤体的机械性破坏所致,也可由卵浆从针眼的外漏所致。另外注射过程中培养环境的改变,如温度的改变也能导致纺锤体的不可恢复的改变。
5.PVP的影响
聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)是一种黏稠的溶液,多数中心在进行精子注射时使用了PVP,但进入到细胞质中的PVP液不能扩散出去,也不能被溶酶体酶消化,将会继续存在细胞质中,这可能对受精、胚胎质量、囊胚形成及以后的发育造成不良影响,因此PVP液不能被看作是绝对无害的物质。有研究探讨不使用PVP液的效果及临床结局,发现与使用PVP液组相比,不使用PVP液组的受精率较高,胚胎的质量也较好。近年来,多数中心已改用更安全的PVP替代品进行ICSI,也有采用M-HTF直接进行ICSI的报道。