未成熟精子受精
ICSI最早应用于IVF受精失败的男性不育者,随后对取自输精管、附睾、睾丸的精子,冷冻精子,无顶体的圆头精子以及尾部发育不良而完全不活动的精子进行ICSI。成熟精子可定义为具有成熟的形态结构及染色质,具备运动能力和精卵识别、结合能力的精子。随着体外培养系统的完善,采用未成熟精子于细胞体外培养成熟后进行ICSI均获得妊娠。目前ICSI应用范围在逐渐扩大。睾丸精子细胞受精及胚胎移植成功,说明睾丸精子和附睾精子的核的功能及遗传物质已基本发育成熟,在生殖医学理论方面也具有重要意义。在本节中,所述未成熟精子细胞主要为成熟精子的前体细胞,包括精子细胞和精母细胞。
未成熟精子的研究主要集中于2个方面:生精细胞体外分化培养技术和精子前体细胞的显微注射技术。
(一)生精细胞体外分化培养技术
同未成熟卵母细胞体外成熟的思路相似,生精细胞体外分化通过体外培养,为未成熟生殖细胞提供适宜的环境,促进其分化成熟,如精母细胞或精子细胞在体外培养分化以获得更接近成熟阶段的精子细胞甚至精子。
1.生精小管体外培养
尽管有丰富的体外精子发生的动物实验数据,然而关于人类体外精子发生的研究依然很少。1998年,Tesarik进行人生精小管片段培养,发现梗阻性无精子症患者的生精细胞在卵泡刺激素(FSH)的作用下很快(24 h)发生减数分裂,表现为减数分裂形成的成对次级精母细胞和圆形精子细胞数量显著增加,此外,FSH还显著促进精子细胞变形过程中的细胞核的成熟。1999年,Tesarik收集了5例精子发育停滞于初级精母细胞阶段和4例停滞于圆形精子细胞阶段的不育男性患者的生精小管片段进行体外培养。前5例中发现只含有4n DNA的生殖细胞,而没有发现含2n DNA和1n DNA的生殖细胞。体外培养了2 d后,有2例出现含有1n DNA的精子细胞,其后将此精子细胞注射到卵子后,获得受精和胚胎发育,胚胎移植后有1例患者获得双胎妊娠并于36周分娩出2个健康婴儿。4例停滞于Sa期圆形精子细胞阶段的新鲜标本经体外培养后,有2例获得长形精子细胞,用这些长形精子细胞进行卵子注射和胚胎移植后,1例为输卵管异位妊娠,1例为足月正常妊娠并娩出1个健康婴儿。这一研究表明,在FSH作用下,减数分裂前的生殖细胞在体外可迅速完成减数分裂及其后的分化过程,并进一步地获得更接近成熟阶段的精子细胞。进一步的研究表明,大剂量FSH(500 IU/L)和睾酮(10 nmol/L)促使体内发育阻滞的生精细胞向前分化至更成熟阶段。大剂量FSH的作用机制可能是支持细胞在体外培养过程中,对FSH反应性降低或者生精阻滞患者体内血清FSH浓度升高,而FSH受体反应性降低,需要超过生理剂量的FSH刺激方能维持精子发生。生精小管的体外培养,保留了支持细胞和生精细胞之间的连接,从而使支持细胞发挥支持生精细胞分化成熟及免于凋亡的作用,这被认为是该培养系统取得成功的关键所在。该培养系统最大的争议在于培养过程中可能对DNA造成损伤以及出生后代的遗传异常。但研究者认为体外培养过程中,染色体可以正常进行减数分离,但某些控制精子形成阶段的所需m RNA和蛋白的关键过程可能被绕过,从而以比体内更快的速度在体外完成减数分裂和成熟。事实上,体外成熟的精子不具有典型的精子形状,这可能是关键过程被绕过所致。目前这一研究尚存在诸多疑问和争议,需要更多的研究证实。
2.生精细胞与饲养层细胞共培养
最常用的饲养层细胞是支持细胞。支持细胞与生精细胞共培养,在动物实验中已经证明了可行性,并成为各阶段生精细胞发育分化的研究模型。人体内发育阻滞的生精细胞在生精细胞-支持细胞共培养中亦可发生分化,而且得到的精子细胞具有受精和启动胚胎发育的能力,但尚没有用于临床治疗的报道。与生精小管片段培养相比,生精细胞-支持细胞共培养中细胞连接经历了断开-重建的过程,但并未显著影响支持细胞对生精细胞生长分化的支持作用。因为人类缺乏足够的支持细胞制作饲养层,非洲绿猴肾细胞系(Vero)或人成纤维细胞作为可选择的饲养层细胞得以实验性研究。非梗阻性无精子症患者的圆形精子细胞在Vero细胞饲养层可以分化为长形精子细胞。此种方式促进体外减数分裂及分裂后成熟似乎更有效,体内发育阻滞的初级精母细胞在Vero细胞饲养层上培养2 d即可完成减数分裂,生成圆形精子细胞。但临床应用方面仍有很多问题有待解决,而且Vero细胞始终是异源物,传代培养中血清等物质的应用更增加了异源污染的可能性,这也涉及安全性问题。
目前,人类精子细胞体外培养受精的技术及机制仍未成熟和明确,仍然无法广泛应用于临床。随着干细胞研究的发展,很多研究者将目光转移到精原干细胞的研究上来。
3.精原干细胞的研究(https://www.daowen.com)
精原干细胞具有自我更新和在适当条件下发生分化的能力,是体内全部生精细胞的源头。在精原干细胞基础上进行体外分化,是一种与生精细胞原代培养分化截然不同的研究方式,是全新的研究领域。研究者在新生小鼠A型精原细胞中进行端粒酶超表达,建立精原干细胞系,该细胞系经体外长期培养仍保持A型精原细胞的特征,并在干细胞因子刺激下分化为精母细胞和精子细胞。对未经转化处理的精原干细胞的长期培养相对困难,需采用饲养层细胞或与其他细胞共培养,且需要多种维生素、氨基酸、生长因子的添加。由于精原干细胞通过体外基因治疗可以纠正遗传缺陷,通过冻存可以保种,通过增殖产生大量、均一的精原细胞,可用于多次体外分化实验,其相对于数量十分有限的原代生精细胞成功概率将大为增加,因而精原干细胞研究将为生精阻滞患者提供更多的治疗机会。目前已有从非梗阻性无精子症患者睾丸组织中分离出精原干细胞样细胞的报道,该细胞呈克隆样生长,当传代数超过10代时克隆逐渐消失。用藻酸钙包被该精原干细胞样细胞,在适合细胞分化的培养液中培养6周后得到了单倍体精子细胞。由于人诱导性多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)在体外可分化为类精子细胞,也有学者提出可以从男性不育患者的体细胞中产生特异性的hiPSCs,并在体外分化获得功能生殖细胞,为不育夫妇提供新的治疗策略。
(二)精子前体细胞的显微注射技术
1.精子细胞显微注射技术
精子细胞显微受精技术是在经历了成功的动物实验后立即用于临床的。1994年,Ogura等首先在小鼠中使用圆形精子细胞作为配子,显微注入卵细胞质中获得了妊娠并生育了子代,这表明在精子发生过程中,减数分裂后精子形成阶段的唯一作用是使精子具备把正常的单倍体雄性基因运送至卵子的功能。同时这一实验也表明精子细胞已具有完整的男性基因组印迹。基因印迹使得只有通过一个雄性配子和一个雌性配子的受精结合才能获得正常的胚胎发育。精子细胞足以支持胚胎发育的事实意味着在精子形成阶段之前雄性基因组已获得印迹或具有印迹的潜能。但值得注意的是小于1%的活产率。他们注射了475个卵子方获得4个小鼠的出生。同年Edwards等据此结果建议对非梗阻性无精子症患者可以在临床上使用圆形精子细胞治疗。
2.精母细胞的显微注射技术
人类精子发生可以停滞于任何阶段,但发生于精母细胞的阶段可能性最大,因为精子发生减数分裂阶段最容易发生错误与障碍。那么精母细胞可以用来辅助生殖吗?
从遗传学的角度,一个精子和一个卵子的受精是可以接受的,因为精子和卵子都是单倍体细胞,而一个次级精母细胞和一个MⅡ期的卵子受精并发育成一个活的后代是不寻常的,因为这两种细胞都含有单倍体2倍的DNA含量。进入卵子后,次级精母细胞核对卵浆中的一些因子发生反应,染色体凝集并形成中期板;电激活卵子,雌雄双方的中期染色体同步进入后期,排出极体并形成原核,其后发育到一定阶段的合子或胚胎被移植入假孕鼠体内。1995年Kimura和Yanagimaehi第一个将小鼠次级精母细胞的核注入成熟卵子并成功获得了下一代。注入的精母细胞的核并没有激活卵母细胞,而只形成2个间期的纺锤体,此后进行电激活。激活后约75%的注射卵子和精母细胞完成了它们的第二次减数分裂,同时排出2个极体并形成一个雄原核和一个雌原核。将29枚胚胎移植到假孕鼠体内后成功获得了7个新生小鼠,总的成功率约15%(即活产与注射卵子的比例)。这一研究表明小鼠精子生殖细胞的配子印迹可能在生精细胞第二次减数分裂之前就已完成,同时也使对精子发生停滞于次级精母细胞的男性不育患者的辅助生殖治疗成为可能。Sollkitis在1998年做了利用取自非梗阻性无精子症患者的次级精母细胞进行显微注射,诞下一男孩。
学者们对初级精母细胞显微注射技术的可能性也做了多种方式的研究并成功获得了新生小鼠。但其成功率相当低,仅为0.6%～2.3%。其可能的原因是第一次减数分裂时精母细胞姐妹染色单体的未成功分离以及卵裂时染色体的断裂或重排。
(张 玲 孙平平)