显微受精技术
一、显微受精技术简史
常规IVF技术对男性不育患者特别是极度少精、弱精患者,受精率极低,这一直是体外受精助孕技术中的难题,主要原因是精子不能穿过卵透明带从而实现精卵融合。提高体外受精技术对改善这些男性不育患者的受精率已变得十分重要。显微受精技术在一定程度上提高了精子质量较差的男性不育患者的受精率,特别是卵细胞质内单精子注射(ICSI),开创了人类生殖的第二场革命,解决了很大一部分男性不育患者的生育问题。
显微注射技术早在20世纪60年代就已经开始应用,主要用于体细胞核移植实验。研究者们同时也开始了动物精子显微注射技术的探索。进入70年代后,在畜牧业方面,哺乳动物的体外受精技术等有了很大发展,并开始选用哺乳动物的精子进行显微注射,积累了较多的经验。通过动物实验发现将单个精子注射入卵细胞内,精卵细胞膜可融合,若注射多个精子,大多数卵细胞发生变性。
20世纪80年代末显微操作辅助受精技术影响了男性不育症治疗的发展。1987年Lans-king等首次将人精子注入人卵透明带下。1988年,Cordon与Talansly采用生化方法在透明带上穿孔,让精子进入卵周间隙以达到精卵融合。Cohen等报道透明带部分切除,成功妊娠并分娩活婴。其后Ng等透明带下授精亦获得妊娠成功。上述方法虽部分克服了男性因素受精障碍,但由于在精子与卵子融合之前必须自发地发生顶体反应、对精子数目及活力要求高,而且多精受精无法控制、妊娠率均较低,影响了临床应用。
1988年Lanzendort等首先报道将单个人精子直接注射入人卵子的胞浆内并成功受精。1992年Palermo等采用卵细胞质内单精子注射(ICSI)显微受精技术,将单个精子直接注射到成熟的MII期卵细胞质内,从而绕过了自然受精过程中许多步骤,如精子与透明带结合、顶体反应、精子细胞膜与卵子细胞膜的融合等。此种方法在显微注射前精子无须发生顶体反应,不受精子浓度、活动度、形态等的影响,获得较高的受精率和胚胎种植率。ICSI显微受精技术在治疗男性少精子症、弱精子症、无精子症方面获得了突破性进展,解决了体外受精助孕技术中的大难题。现在ICSI已成为因男性因素引起严重不育的重要治疗方法。
二、显微受精的种类
1.透明带钻孔法和部分透明带切割法
透明带是卵母细胞外一层细胞结构的糖蛋白,它的主要功能是识别精子并与精子发生结合,并选择性地让单个精子穿透透明带,同时防止多精受精;此外还对受精卵起到保护作用,有利于胚胎的生长发育。受精时精子首先必须穿透透明带。透明带钻孔法(zona drlling,ZD)是采用化学的方法,包括用酸化的Tyrode溶液或蛋白水解酶如糜蛋白酶来处理透明带。部分透明带切割法(partial zona dissection,PZD)是采用机械的方法,如用玻璃针刺破透明带,造成透明带下有一小的裂口,然后将卵细胞放入含精子的培养液中,使精子通过裂口顺利穿透透明带,与卵子融合,形成受精卵,发育成胚胎。该方法简单,对卵细胞造成的损伤较小。但各IVF中心报道的PZD单精受精率不完全一样,此外,PZD要求精子数目较多(＞5×l04/ml),而且多精受精率较难控制,并可能影响胚胎的进一步发育,目前临床应用较少。
2.透明带下受精
透明带下受精(subzonal insemination,SUZI)指将精子通过显微注射法直接注入卵膜周隙(perivitelline space,PVS)。该方法最早由Ng等于1988年使用,并获得成功妊娠。1990年,Fishel等报告第一例成功分娩,该方法很快被许多IVF中心接受。受精率与注射的精子多寡有关,注射的精子愈多,受精率也愈高,但多精受精率也随之升高。一般以注射3～5个精子为宜。完全无运动的精子及尾部纤毛结构异常的、丧失运动能力的精子通过SUZI均能成功受精。将顶体完整的精子注射到PVS,它并不能与卵子的浆膜发生融合,只有将发生顶体反应后的精子注射到PVS受精率才明显增加。目前SUZI已很少应用。