miRNA下游靶基因的预测及鉴定

预测并鉴定miRNA的靶基因，对阐明该miRNA下游的调控途径具有重要意义。目前，最常用的miRNA靶基因预测方法是通过计算机预测，主要通过一些预测软件进行，包括miRanda、RNAhybrid、PITA、TargetScan、PicTar等。miRanda、RNAhybrid 和PITA算法主要是依据mRNA二聚体的热力学稳定性，热力学稳定性越高，则其为靶基因的可能性越大。TargetScan最初主要考虑mRNA靶位点的碱基序列在多物种之间的保守性，以此来减少预测结果的假阳性，然而当某一miRNA与mRNA的结合具有物种特异性时，这种方法显得毫无用处。现在TargetScan网站上也提供了非保守的miRNA靶标。PicTar算法则采用了一种组合的方法，不仅考虑同一个miRNA的多个mRNA结合靶点，而且计算出了每一种结合的可能性。单一软件预测往往得到成百上千的结果，而且假阳性率高。采用多种软件联合预测可缩小靶基因的范围，降低假阳性率，但最终得到的靶基因仍然很多。

此外，还可以用全基因组表达谱芯片预测miRNA的靶基因。通过在细胞内过表达某种miRNA，同时设立相应对照，分别进行全基因组表达谱芯片检测。与对照组相比，过表达miRNA组下调的基因很可能是该miRNA的靶基因。然而，在哺乳动物体内，miRNA很少引起靶mRNA降解，而仅抑制其翻译，miRNA的靶mRNA表达不一定有变化。由于miRNA主要引起靶基因的蛋白表达，有学者通过iTRAQ的方法筛选细胞过表达miRNA后的负向差异表达蛋白，但这些差异表达蛋白并非都是miRNA直接调控的靶基因。RIPchip是用针对 Argonaute（Ago）蛋白家族成员（这组蛋白已知与miRNA结合并与特异性靶mRNA互补序列结合）的抗体，沉淀含有miRNA和靶基因mRNA的混合物，进一步通过芯片检测筛选miRNA的靶基因。这种方法的显著优点是可以对某种miRNA所有直接结合的mRNA进行较为全面的鉴定。然而，具有miRNA的结合位点且直接与miRNA结合的基因，并非都是miRNA的功能靶基因。

以上预测miRNA靶基因的方法各有优缺点，实际研究过程中多采用两种或三种方法联合预测，取其交集，以缩小靶mRNA的范围。通过对靶基因进行文献回顾、GO和Pathway分析及结合功能实验结果，进一步筛选靶基因，可提高鉴定的成功率。(https://www.daowen.com)

目前，鉴定miRNA靶基因的金标准是双荧光素酶报告基因实验。将目的基因3'-UTR区构建至载体中报告基因luciferase的后面，通过比较过表达或者干扰miRNA后，报告基因表达的改变（监测荧光素酶的活性变化）可以定量反映miRNA对目的基因的抑制作用；结合定点突变等方法可进一步确定miRNA与靶基因3'-UTR区的作用位点。

（李 峰）