二、红系造血调控

二、红系造血调控

在红细胞形成早期，HSC产生高度增殖的红系前体细胞，先是BFU-E，然后是CFU-E。红系前体随后进行末端分化，依次产生不同群体的红系前体。在这个过程中，细胞的大小逐渐缩小，细胞膜重新组织。随着核糖体的积累，细胞质首先变为嗜碱性，然后由于HGB的大量产生而变为嗜酸性，而核由于染色质的逐渐凝结而变得更小，最后脱出细胞核、内质网等，形成网织红细胞。在成熟过程中，网织红细胞失去核糖体，重新组织细胞骨架和细胞膜，获得红细胞独特的双凹形状［3］。红系造血是一个严密调控的系统，每个发育阶段都有一个独特的转录程序，在发育的早期阶段会出现一系列红系特异性基因表达，随后逐渐沉默，这些转录变化受复杂的调控网络控制，包括基因组调控区域（即启动子和增强子）和主转录因子之间的功能相互作用。特别地，增强子是红细胞生成早期基因表达程序的主要决定因素。

红细胞与巨核细胞（megakaryocyte，MK）的祖细胞具有许多共同特征，它们分享许多转录因子（SCL、GATA-1、GATA-2和NF-E2）、细胞表面分子（TER119）和细胞因子受体（IL-3、SCF、EPO和TPO），并且多数红系和MK白血病细胞系表达或能被诱导表达其他系统的特征。此外，这两个与系统发育最相关的细胞因子EPO和TPO是造血生长因子家族中最为密切相关的蛋白质，在刺激两个系统祖细胞的生长方面具有协同性，由上述原因和其他原因可推测出红细胞系生成和MK生成分享共同的祖细胞（见图2-1）。

图2-1　影响红细胞生成的因子

HSC：造血干细胞（hematopoietic stem cell）；MPP：多潜能多能祖细胞（multipotential pluripotential progenitor）；CMP：髓系共同祖细胞（common myeloid progenitor）；MEP：巨核-红系祖细胞（megakaryocyte-erythrocyte progenitor）；EP：红系祖细胞（erythrocyte progenitor）；MKP：巨核系祖细胞（megakaryocyte progenitor）
A：影响红细胞生成的生长因子；B：影响红细胞生成的转录因子

（一）影响红细胞生成的生长因子

1.干细胞因子

干细胞因子（stem cell factor， SCF），亦称Steel因子（SLF）、肥大细胞生长因子（mast cell growth factor，MGF）或c-kit配体，SCF的受体是原癌基因c-kit编码的蛋白，也被称为CD117。它是由骨髓微环境中的基质细胞产生的一种酸性糖蛋白［4］。SCF有可溶性和膜结合型两种存在形式，均具有生物学活性。SCF结合c-kit而激活的细胞内介质包括磷酸肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）、丝裂原激活蛋白激酶（mitogen activation protein kinase， MAPK）、磷脂酶C和原癌基因c-Src。SCF和其他细胞因子一起诱导干细胞和祖细胞增生、延长其存活期及引起干细胞和祖细胞动员。虽然SCF的受体在祖细胞无显著不同，但SCF诱导红系祖细胞增生比粒细胞单核细胞系造血祖细胞强，可能是其他特异性因素影响了祖细胞对SCF的反应性。

SCF造血作用非常重要，其基因缺陷小鼠可出现HSC数量或质量下降，从而引发重度贫血，甚则由于多种发育缺陷而具有胚胎致死性；除了胚胎和胎儿造血发育中的关键作用外，用抗体处理来中和成年小鼠SCF的受体c-kit也可导致重度全血细胞减少，这表明SCF受体/配体对机体有重要造血作用；SCF在血液中的水平维持相对恒定，不依赖于血细胞数量的变化［5］。

2.促红细胞生成素及其受体

促红细胞生成素（EPO）是一种含有165个氨基酸和4个碳水化合物侧链的糖蛋白。其分子质量为30 kDa，其中40%为碳水化合物［6］。EPO受体（erythropoietin receptor，EPOR）是一类细胞因子受体超家族的成员，在胞外结构域包含一个WSXWS基序（色氨酸-丝氨酸-某种氨基酸-色氨酸-丝氨酸基序）、一个单一跨膜结构域、一个缺乏酪氨酸激酶活性并与JAK激酶（janus kinase，一种细胞内非受体酪氨酸激酶家族）相联系的胞浆区，并可形成同源二聚体、异源二聚体或异源三聚体等复合物［7］，EPO与其同源二聚体受体复合物结合，使胞浆区相联系的JAK2激酶距离接近，从而实现JAK转磷酸化、受体磷酸化、信号转导子和转录激活子（signal transducer and activator of transcription，STAT）和其他下游信号通路的磷酸化和激活，磷酸化的STAT5亚基STAT5A和STAT5B，二聚化并转移到细胞核以激活选择基因表达［8-9］。

在胎儿阶段，EPO主要在肝脏产生［10］，出生后，EPO生成部位逐渐转移至肾脏，成年人体内约85%的EPO由肾脏产生，红细胞的产生亦从胎儿的肝脏转移到骨髓，骨髓是成人造血的部位［11］，肾小管周围间质细胞是EPO的产生细胞。EPO在肝脏和肾脏以外的组织中也有表达，包括大脑和神经细胞、脾脏、肺和骨髓，但不能替代肾脏提供所需的红细胞生成调节［8］。缺氧可使产EPO细胞数量增加，从而诱导EPO产生增加［12-15］。

红细胞生成需要EPO，敲除EPO或EPOR基因的小鼠会在13.5 d左右在子宫内死亡，原因是胎儿肝脏的红细胞生成中断，导致严重贫血［8］。红细胞生成是一个复杂的过程，涉及许多祖细胞的连续生长，EPOR在CFU-E阶段表达最高，这一阶段成为对EPO水平变化最敏感的阶段。EPO与红系祖细胞上的受体结合，可增加红系转录因子GATA-1和碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子T细胞急性白血病蛋白1（T-cell acute leukemia protein 1， TAL1）的表达，从而反式激活EPOR的表达，因此，EPO可调节其自身受体的表达［16］。在早期BFU-E阶段的EPO结合，低水平EPOR诱导GATA-1和TAL1激活包括EPOR在内的红系增殖反应。EPOR随着红细胞分化的进展而下调，在网织红细胞上未检测到，网织红细胞增多仅在循环EPO急性增加后延迟约3 d才变得明显。缺乏EPO会阻碍红细胞的生成，在长期情况下会导致贫血［6］。

对人脐静脉和牛肾上腺毛细血管原代内皮细胞的培养显示，EPOR在内皮细胞中表达。在内皮细胞中，内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitricoxide synthase， eNOS）产生NO调节血管张力和血压。EPO刺激内皮细胞可激活eNOS和NO的产生，特别是在缺氧时［17］，高表达人EPO的转基因小鼠（HCT约为80%）也明显增加eNOS水平和NO的产生［18］。EPO刺激内皮细胞亦会增加内皮素-1（endothelin-1， ET-1）的分泌，产生缩血管反应［19］。由缺氧或缺血应激诱导的EPO可刺激红细胞的产生，以改善氧气输送，增加氧气从肺到组织的运输，然而，红细胞产量的增加需要骨髓和小鼠脾脏中红系祖细胞增殖和分化增加来扩大红细胞谱系，因此，EPO促进NO的诱导作用提供了一种调节血管张力和改善氧气输送的急性反应潜力，这种急性反应与刺激红系祖细胞的存活、增殖和分化，以及产生成熟红细胞所需要的时间形成对比［8］。

除内皮细胞外，在其他非红细胞组织中，EPOR的表达也提供了缺血或损伤时组织特异性的EPO保护反应。EPOR的表达和活性也体现在以下组织中。内皮细胞可调节血管张力，改善氧输送，对缺血性损伤提供心脏保护；EPOR可对大脑，特别是神经元，缺血应激或损伤有保护作用；成肌细胞用于组织维护或修复的骨骼肌；白色脂肪组织（脂肪细胞和巨噬细胞）可保护雄性小鼠在饮食引起的肥胖期间免受炎症和脂肪量增加的影响；骨髓间充质干细胞和成骨细胞能维持正常的骨发育和骨重塑，同时伴有外源性EPO刺激红细胞生成［8］。

3.血小板生成素

血小板生成素（thrombopoietin，TPO）是血小板产生过程中最为关键的调节因子，又称巨核细胞生长衍生因子（megakaryocytes growth development factor，MGDF）［20］。TPO是一种45～70 kDa的激素，促血小板生成素与EPO具有广泛的序列同源性，同一性达20%，另有25%的类似性。该激素由多种器官产生，包括肝脏、肾脏、骨骼肌和骨髓基质。TPO是巨核细胞祖细胞扩增和分化的主要调节因子，该激素作用于MK祖细胞，促进其存活和增加，作用于不成熟的巨核细胞，促进其分化，但不作用于血小板形成阶段的成熟细胞。此外，由于TPO对维持HSC至关重要，因此它可以真正被描述为一种泛造血细胞因子［21］，该激素支持潜在造血干细胞群体的存活，并与IL-3和SCF协同作用，诱导这些细胞进入细胞周期，并促进其向原始和各系定向造血祖细胞的转变。研究表明，高原缺氧环境下，TPO值明显高于平原，慢性高原病患者TPO水平明显高于同一环境下的正常人，提示TPO与慢性高原病的发生有一定关系［22］。

TPO受体与细胞原癌基因c-Mpl的产物一旦结合就会使c-Mpl形成同型二聚体、激活JAK2激酶，导致胞内结构域的3个酪氨酸残基磷酸化。这些磷酸化的酪氨酸残基作为几个二级信号分子的对接位点，包括STAT、MAPK和PI3K，最终导致多个转录因子［如同源盒蛋白、缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF）］的表达和细胞存活分子［如B细胞淋巴瘤-xl基因（Bcl-xl）］的表达［5］。

虽然EPO和TPO都能激活JAK2，但前者导致STAT5的激活，而后者导致STAT1、STAT3和STAT5的激活，最终靶向一系列不同的基因。此外，激活整合素α5β1（VLA5）介导的信号促进EPO诱导的红细胞发育，而激活VLA4介导的信号则抑制红系造血而促进TPO诱导的巨核细胞生长。

4.性激素(https://www.daowen.com)

男性和女性慢性高原病患病率有很大差异，女性少见患病，但绝经后女性的慢性高原病发病率急剧增加［23］。睾酮（Testosterone）主要由男性睾丸分泌，在肝脏失活，属于类固醇激素，具有合成蛋白质、维持电解质平衡及保持雄性体征的作用，与机体多系统功能有关，如机体造血，糖类、脂质代谢，保持体内钙平衡和前列腺增长等［22］。研究表明，睾酮降低肺通气并增加红细胞生成，以剂量依赖的方式刺激男性红细胞的产生，特别是老年男性［24］。睾酮下调肝铁调素mRNA表达，上调肾EPO mRNA表达，并增加EPO水平［25］。睾酮促进红系祖细胞及EPO敏感细胞的数量增加，刺激正铁血红素的合成，也直接作用于骨髓引起红细胞的生成［26］。

雌激素（estrogen）主要由女性卵巢分泌。与睾酮相反，雌激素增加肺通气并抑制红细胞生成，较高的雌激素水平与较高的动脉氧饱和度有关，这可能是不同性别通气反应差异的原因［24］。雌激素可抵抗缺氧诱导的红细胞生成，并以剂量依赖方式对慢性高原病受试者的红细胞生成产生显著的负面影响。雌激素可显著降低GATA-1和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的mRNA水平，此外，多个GATA-1靶基因（AlAS-2、EPOR、Bcl-xl等）的表达也随着雌激素的增加而显著降低，VEGF可能直接受雌激素调控或通过HIF信号间接与雌激素相关。雌激素使红细胞的凋亡率显著增加，提示雌激素调控红细胞的机制之一是增加红细胞的细胞凋亡［23］。

5.白介素-3

白介素-3（IL-3）是白介素家族重要成员之一，又称多集落刺激因子（multi-CSF），是一种细胞因子。其由T淋巴细胞产生，能够刺激参与免疫反应的细胞增殖、分化并提高其功能；是主要的早期造血生长因子，对造血调控起着极其重要的作用；主要作用于早期造血祖细胞，促进增殖，并与kit配体和晚期分化因子，如EPO、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）一起促进造血祖细胞的分化［27］。

（二）影响红细胞生成的转录因子

IL-3在红系分化过程涉及许多转录因子的调控，如GATA-1、Friend of GATA-1（FOG-1）、红细胞克吕佩尔样因子（erythroid kruppel like factor，EKLF）、Pu.1及SCL/TAL1等，被证实参与红系分化。

1.GATA

GATA家族是一类具有保守Ⅳ型锌指结构域的转录因子，因特异性地与靶基因启动子的A/T（GATA）A/G序列结合而得名［28］，GATA转录因子家族在胚胎发育过程中起着至关重要的作用，在细胞分化和组织形态发生中发挥着复杂而广泛的作用。GATA蛋白对来自所有3个胚层的组织（包括皮肤、大脑、性腺、肝脏、造血系统、心血管和泌尿生殖系统）的发育至关重要。脊椎动物中一般有6个GATA家族成员（GATA-1至GATA-6），根据它们的系统进化关系和组织表达特征，GATA家族分为GATA-1至GATA-3及GATA-4至CATA-6两个亚家族［29-30］，GATA-1至GATA-3亚家族是造血系统和中枢神经系统分化和发育所必需的；GATA-4至GATA-6亚家族在中、内胚层的器官，如心脏、肝脏、肺和生殖腺等中表达，对组织特异性基因的表达起关键性的调控作用［30-31］。

转录因子GATA-1和GATA-2在红细胞生成的基因调控中起关键作用，GATA-1和GATA-2双敲除的胚胎细胞因完全红系缺失而死亡。GATA-2对未成熟造血祖细胞的维持和增殖至关重要，而GATA-1对红系祖细胞的存活和红细胞的最终分化至关重要［3，32］。GATA-1在红细胞、巨核细胞、肥大细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞和树突状细胞中表达，在红系分化过程中，GATA-2在HSC和祖细胞中并先于GATA-1表达，占据部分GATA结合基序［33］。而GATA-1在红细胞成熟过程中高水平表达［32］。GATA-1是红细胞生成的主要调节因子，在共同髓系祖细胞期开始表达GATA-1后，GATA-1水平稳步上升，CFU-E和前体红细胞中表达最高，此后逐渐降低，GATA-1通过激活多种红系特异性基因的表达、抑制kit受体和GATA-2表达，促进红系分化［5，33］。在红细胞分化的早期阶段，缺乏GATA-1的红系祖细胞有可能分化为非红细胞系，同时保留原红细胞的形态，表明GATA-1是红细胞系分化的必要条件。

研究发现慢性高原病患者骨髓红系细胞中HIF-1α和GATA-1的mRNA表达均上调，提示慢性高原病患者的发病原因可能是低氧促进HIF-1α的表达，并影响GATA-1从而促进红系细胞的分化成熟［34］。

2.Nuclearfactor-erythroid2

Nuclear factor-erythroid 2（NF-E2）是由血细胞特异性表达的亚单位P45NF-E2和广泛大量表达的亚单位P18共同组成的基本亮氨酸链状蛋白异二聚体，属于CNC转录因子家族，P45NF-E2在造血前体细胞、红系细胞、巨核细胞、肥大细胞及粒细胞中有表达，对促进红细胞分化、HGB合成及对成熟红细胞抗氧化功能的保持起关键作用。P45NF-E2的转录主要受到GATA-1的调控，GATA-1的表达增高，可加强P45NF-E2的表达而使细胞向红系末端分化。如果应用EPO刺激脐血CD34阳性细胞向红系末端分化时，包括P45NF-E2在内的多种红系特异性转录因子均被上调［35］。

3.FriendofGATA-1

Friend of GATA-1（FOG-1）是一种与GATA蛋白家族相互作用的核蛋白，含有9个锌指结构，可结合于GATA-1的锌指结构。FOG-1可增强或抑制GATA-1转录活性，具体作用取决于二者的结合部位。抑制FOG-1可诱导产生严重贫血和血小板减少［36］。FOG/GATA-1复合物可以共同抑制GATA-2和c-myb的转录，使红系分化正常进行，在FOG-1缺乏的情况下GATA-1不能关闭GATA-2及c-myb的转录，红系停留在祖细胞阶段不能继续分化。一旦细胞的链系分化定向，FOG就和GATA-1共同作用于红系成熟过程［4］。

4.红细胞克吕佩尔样因子

红细胞克吕佩尔样因子（EKLF）是一种含锌指结构的转录因子，在红系分化中发挥重要作用。EKLF与β珠蛋白CACCC序列结合，调控珠蛋白转换。EKLF敲除的小鼠胚胎在发育14.5～15 d后死于严重的红系细胞缺陷。在EKLF缺陷的红细胞中，β珠蛋白mRNA的蛋白水平均下降。EKLF缺陷的小鼠网状内皮系统中铁大量堆积，形成无效红系造血。

5.其他影响因子

Hox转录因子家族对造血细胞非常重要，表现在自我更新/扩增水平的调控，去除Hox基因或去除调控它们表达的基因，都会导致显著性的造血缺陷。与Hox基因类似，抑制Pbx1基因的基因表达也可导致造血干细胞缺陷，例如，Pbx1基因敲除小鼠的髓系共同祖细胞（common myeloid progenitor，CMP）数量显著减少。Pu.1与GATA-1相互作用则通过诱导多能干细胞向髓系和B淋巴细胞系分化并抑制红细胞生成而拮抗红系造血［37］。Notch影响造血干细胞，Notch配体Delta1和Delta4可扩增原始造血细胞，在骨母细胞被实验性扩增的小鼠中，Notch的抑制处理可阻断造血干细胞的扩增；SCL也称为T细胞急性淋巴细胞白血病-1蛋白（TAL1），能与GATA-1结合，促进EKLF等基因的表达，TAL1/SCL在HSC/祖细胞分化和红细胞成熟中起到重要作用［38］，例如，TAL1结合到EPOR启动子激活EPOR表达，从而导致红细胞过度增多［16］。

红系发生及调控机制复杂，详细机制至今尚不完全清楚，探索可能参与红系造血的各种因素并研究其作用机制，将有利于更全面地分析慢性高原病等相关疾病的发病机制。