2.2.2 消毒灭菌技术
细胞培养实验需在严格无菌条件下进行。除了对细胞培养室、操作台、CO2培养箱等进行定期消毒及加强实验过程无菌操作的意识，在避免细胞污染外，实验前培养用品的消毒灭菌处理也是防止污染的关键。
根据消毒物品的特性不同，可采用物理灭菌法、化学灭菌法和抗生素灭菌法。物理灭菌法主要指通过紫外线消毒、离心或过滤、干热或湿热消毒及其他射线处理；化学灭菌法主要指应用化学试剂达到消毒的目的。
下面主要介绍细胞工程实验室常用的消毒方法。
1）物理消毒法
（1）紫外线消毒
紫外线直接照射法可使空气、操作台表面和一些不能使用其他方法进行消毒的培养器皿（如塑料培养皿、培养板等）达到消毒的效果。操作简便，灭菌效果好，是目前各实验室常用的消毒法。
使用紫外灯消毒时培养室的紫外线灯距地面不超过2.0 m，距工作台面的距离不宜超过1.5 m；另外由于各种细菌对紫外线的敏感性不同，所用照射时间和剂量也不同。
紫外线消毒的弊端是易产生臭氧，污染空气，对身体有害；射线照射不到的部位起不到消毒作用，故消毒时，物品不宜相互遮挡。有人习惯于边照射边进行实验操作，这样不好：一是紫外线对细胞、试剂和培养液都有不良影响；二是对人体皮肤也有伤害。
（2）热消毒
热消毒包括湿热灭菌法和干热灭菌法两种。
①湿热灭菌法。为高压蒸气消毒，是最有效的一种方法。布类、胶塞、金属器械、玻璃器皿及某些培养用液均可采用该法消毒。在同样的温度下，湿热的杀菌效果比干热好，其原因是蛋白质凝固所需的温度与其含水量有关，含水量越大，发生凝固所需的温度越低，湿热灭菌的菌体蛋白质吸收水分，而在同一温度的干热空气中易于凝固；温热灭菌过程中蒸气放出大量潜热，加速提高湿度，因而湿热灭菌比干热所要温度低，如在同一温度下，则湿热灭菌所需时间比干热短；湿热的穿透力比干热大，使深部也能达到灭菌温度，故湿热比干热收效好。
湿热灭菌法包括有以下几种：
a.煮沸法：100℃5 min，能杀死一般细菌的繁殖体。许多芽孢需经煮沸5～6 h才死亡。水中加入2%碳酸钠，可提高其沸点达105℃。既可促进芽孢的杀灭，又能防止金属器皿生锈。煮沸法可用于饮水和一般器械（刀剪、注射器等）的消毒。
b.流通蒸气灭菌法：利用100℃左右的水蒸气进行消毒，一般采用流通蒸气灭菌器（其原理相当于我国的蒸笼），加热15～30 min，可杀死细菌繁殖体。消毒物品的包装不宜过大、过紧，以利于蒸气穿透。
c.间歇灭菌法：利用反复多次的流通蒸气，以达到灭菌的目的。一般用流通蒸气灭菌器，100℃15～30 min，可杀死其中的繁殖体；但芽孢尚有残存。取出后放入37℃孵箱过夜，使芽孢发育成繁殖体，次日再蒸一次，如此连续3次以上。本法适用于不耐高温的营养物（如血清培养基）的灭菌。
d.巴氏消毒法：利用热力杀死液体中的病原菌或一般的杂菌，同时不至于严重损害其质量的消耗方法。61.1～62.8℃0.5 h，或71.7℃15～30 s。常用于消毒牛奶和酒类等。
e.压力蒸气灭菌法：是在专门的压力蒸气灭菌器中进行的，是热力灭菌中使用最普遍、效果最可靠的一种方法。其优点是穿透力强，灭菌效果可靠，能杀灭所有微生物。(https://www.daowen.com)
目前使用的压力灭菌器可分为下排气式压力灭菌器和预真空压力灭菌器两类。适用于耐高温、耐水物品的灭菌。
②干热灭菌法。比湿热灭菌法需要更高的温度与较长的时间。
a.干烤：利用干烤箱，160～180℃2 h，可杀死微生物，包括芽孢。主要用于玻璃器皿、瓷器等的灭菌。
b.烧灼和焚烧：烧灼是直接用火焰杀死微生物，适用于微生物实验室的接种针等不怕热的金属器材的灭菌。焚烧是彻底的消毒方法，但只限于处理废弃的污染物品，如无用的衣物、纸张、垃圾等。焚烧应在专用的焚烧炉内进行。
（3）滤过消毒
滤过消毒主要利用细菌等微生物在滤过时不能通过滤膜的微孔而与培养用液分离，从而达到消毒灭菌的目的。大多数培养用液，如人工合成培养液、血清、酶溶液等，这些在高温下会发生变性，失去其功能，不宜用上述方法消毒，必须采用滤过法除菌。
采用滤过消毒法时，必须注意以下事项：
①滤膜用后丢弃，滤器清洗也比较方便，先用毛刷蘸洗涤剂刷洗干净，用自来水冲洗后，再用蒸馏水冲洗，晾干即可。
②用前再装上一张新的滤膜。
③消毒时旋钮不要扭得太紧，凡与空气接触部位都用纸包装好，以保证消毒时的效果。
④消毒后，在无菌环境中立即将旋钮扭紧。
⑤滤过少量液体时，用一种能安装在注射器上的小滤器，使用相同的滤膜，滤过时把滤过物装入注射器针管内，压出过滤物注入无菌容器中即可。
2）化学消毒法
化学消毒剂主要用于那些无法用其他方法进行消毒的物品，如操作者的皮肤、操作台表面、无菌室内的桌椅、墙壁和空气等。常用的化学消毒剂有甲醛、来苏儿、新洁尔灭、过氧乙酸和75%酒精等。
甲醛水溶液为无色，是具有强烈刺激性气味的液体，可杀灭多数微生物，价廉，熏蒸消毒时不损坏衣服、家具、皮革、橡胶等。室内消毒其用量为20～25 mL／m3，在加热该溶液时最好同时煮沸一壶水，使室内相对湿度保持为70%～90%，室内温度最好在20℃以上，作用时间12～24 h。来苏儿对皮肤有刺激性，不能用作皮肤消毒剂，常用于培养室地面的消毒。1%新洁尔灭是细胞培养实验室常用的消毒剂，器械、皮肤和操作台表面均可用它消毒。过氧乙酸消毒能力极强，可用作各种物品的表面消毒，使用时需用水稀释后，采用喷洒或擦拭的方法消毒即可。75%酒精对活细胞毒性小，常用于器械的浸泡消毒、瓶皿开口部位和皮肤消毒。
3）抗生素消毒法
在进行组织或细胞培养实验时，为了预防因操作不慎等原因造成细胞培养污染，常在培养液中加入一定剂量的抗生素液，抑制微生物污染。
