4.2.4 影响原生质体数量和活力的因素
原生质体培养成功的首要条件是获得大量、完整、有活力的原生质体。影响其数量和活力的主要因素有供试材料、酶类组合及酶解时间、渗透压稳定剂、质膜稳定剂、pH、光照、温度等。
1）供试材料
植物种类、所选材料生理和发育状态、供试材料生长条件等因素均对分离出的原生质体数量和活力有很大影响。研究者发现下列材料是比较理想的分离原生质体的供试材料。
（1）自然生长材料的幼嫩叶片
这类材料取材方便，来源广泛，在适宜处理条件下，可以获得大量活性较高的原生质体。如用木本植物英国榆的叶片做材料，对从顶端生长点处数第一片叶即幼嫩叶、第二片叶和第三片叶即老叶进行原生质体分离，发现幼嫩叶的原生质体产量和存活率均明显高于老叶。
（2）无菌实生苗子叶和下胚轴
种子易于灭菌，可以在短期内获得大量的供试无菌苗。子叶和下胚轴细胞年幼，具有较强的分裂和成苗能力，能产生较多的具高分生能力的原生质体。这种原生质体中的叶绿素含量较少或不含叶绿素，在体细胞融合中可以与来自叶肉细胞的含有大量叶绿素的绿色细胞区别，有利于杂种细胞筛选。
（3）外植体来源的愈伤组织和细胞悬浮培养物
这些材料不受外界环境的影响，实验重复性好，产生的原生质体产量、活性和稳定性等比较理想。还可以借鉴组织培养的经验，对原生质体的培养及其再生植株的形成做初步评估。但是，多次继代的细胞容易出现染色体结构和数量变异，影响原生质体培养和植株再生，应选用稳定的培养细胞系，尽可能减少继代培养时间。
（4）花粉细胞
花粉原生质体具有单倍体和原生质体的双重优点，花粉具有群体数量大、一致性好和取材方便等优点，是植物细胞工程中一种特殊的实验体系。(https://www.daowen.com)
2）酶的种类、组合和酶解时间
不同植物种类、组织和细胞分解细胞壁所需酶的种类、浓度、组合及酶解时间也不相同。如草本植物利用纤维素酶类和果胶酶类中的2～3种酶组合成的混合酶液即可达到原生质体分离的目的，一般纤维素酶浓度为0.5%～3%，果胶酶浓度为0.1%～1%；成熟花粉粒和四分体小孢子原生质体分离时除需纤维素酶类和果胶酶类外，尚需降解胼胝质层的蜗牛酶和胼胝质酶，其浓度为0.5%～2%。在适宜酶液组合下，酶解时间变化较大，为30 min～20 h。如马铃薯花粉原生质体的酶解时间为3～4 h，杨树愈伤组织为9～12 h。
3）渗透压稳定剂
原生质体内部渗透压受基因型、细胞年龄、培养时的光照和温度以及取材时间和部位等因素的影响，渗透压值为一变动的数值。根据定量观察，原生质体在轻微高渗溶液中比在等渗溶液中更为稳定。在制备原生质体时，常由于细胞壁的解除和壁压的消失将引起细胞破碎。因此在酶液、原生质体洗涤液、培养液中必须调整渗透压，维持细胞内外渗透压的平衡，防止细胞涨破或过分收缩而破坏内部结构。常用的渗透压稳定剂为甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖、盐类（如KCl、MgSO4·7H2O等）。
4）质膜稳定剂
为了增加完整原生质体数量，防止质膜破坏，促进原生质体细胞壁再生和细胞分裂形成细胞团，需在酶液中加入质膜稳定剂。常用的质膜稳定剂为葡聚糖硫酸钾、2-（N-吗啉）-乙烷磺酸、氯化钙（浓度0.1～1.0 mmol／L）、磷酸二氢钾等。
5）pH
酶活性与pH有关。酶活力和细胞活力最适pH不完全一致，如纤维素酶R-10和离析酶R-10的最适pH分别为5～6和4～5，而细胞活性的pH一般为5～6。低pH（pH＜4.5）。酶的活力强，原生质体分离速度快，但细胞活力差，破坏的细胞较多；pH偏高，酶活力差，原生质体分离速度慢，完整原生质体数目较多。
6）光照和温度
酶活力与温度也有关系，分离原生质体所用的各种酶的最适温度为40～50℃，但这种温度细胞无法适应。分离原生质体所用的温度一般为25～30℃。由于脱壁的原生质体对光非常敏感，故分离原生质体的过程一般是在黑暗条件下进行的。
