9.3.2 细胞克隆技术
细胞克隆技术又称单细胞克隆技术或单细胞培养技术，即从细胞群体中分离出一个细胞进行单独培养，使其繁殖成一个新的细胞群体，这种由单个细胞所形成的细胞群（或集落）称为一个克隆，这种经纯化后的细胞群体称为细胞株。它们当中每个细胞的遗传特征和生物学特性极为相似和一致，有利于对不同群体细胞的形态和功能进行比较和研究。就理论上而言，各种细胞都可用来进行克隆培养，但实际上能够进行克隆培养的细胞一般只是一些细胞活力强、增殖能力强以及对体外生长环境适应性强的细胞。原代培养细胞和有限细胞系克隆培养比较困难，无限细胞系、转化细胞系和肿瘤细胞则比较容易。细胞克隆技术有多种方法，常见的有稀释铺板法、饲养层克隆法、胶原模板或血纤维蛋白膜层板克隆法、琼脂克隆法等。
1）稀释铺板法
先制备低密度的细胞悬液，在培养板的各孔中分别接种细胞悬液，使每孔平均含1个细胞，也可用培养皿或培养瓶作为培养器皿。置于37℃5%CO2培养箱内培养，待细胞下沉并贴附于培养板孔底后，取出在倒置显微镜下观察，标记含单细胞的孔，然后放回CO2培养箱中继续培养。数日后，凡在已标记的孔中有生长增殖的细胞即为克隆细胞。待孔内细胞增殖至500～600个时将克隆分离，重新接种扩大培养。稀释铺板法克隆培养操作过程如图9.5所示。
2）饲养层克隆法
细胞的生长增殖除取决于细胞特性、培养体系和培养条件外，还需要一定的细胞密度。为促使刚刚克隆化的极少量细胞生长增殖，可使用“饲养细胞”来促进克隆的形成。“饲养细胞”也称滋养细胞，是一层经过丝裂霉素C处理或射线照射后失去分裂能力，但仍存活，能促进克隆细胞生长的细胞层。常用的有成纤维细胞、胸腺细胞和巨噬细胞等。因为饲养细胞制备较为烦琐，在应用稀释铺板法克隆培养细胞后，已很少再用。但作为生长基质，用以培养某些难培养的细胞时仍有一定的应用价值。
饲养层的制备方法：取人或动物胚胎成纤维细胞等用胰蛋白酶消化后接种入培养瓶内。待细胞生长到半汇合状态时，按2μg／106个细胞的量加入丝裂霉素C后过夜，或者用剂量为30～50 Gy射线照射处理培养物。以BSS漂洗培养物后换新鲜培养液再培养24 h。用胰蛋白酶消化后，再用培养液制成细胞悬液，一般按细胞数104个／cm2接种到培养皿内，放置于CO2培养箱内培养24～48 h后，倒掉旧培养液，细胞层作为克隆化的饲养层。将稀释细胞数为20～30个／mL的细胞悬液接种到具有饲养层的培养皿内，另外将细胞悬液接入没有饲养层的培养器皿内作为对照。接种后放置于CO2培养箱内培养。每周或2～3天更换培养液，培养2～3周观察克隆的形成，最后检测并计克隆数目。
图9.5 稀释铺板法克隆培养操作示意图(https://www.daowen.com)
3）胶原膜板或血纤维蛋白膜板层克隆法
原代培养细胞容易黏附于胶原膜层或血纤维膜层等生长基质之上。在细胞克隆中，用胶原膜层或血纤维膜层代替饲养细胞可帮助单个细胞和密度极低的分散细胞黏附和贴壁、存活并逐渐增殖。
血纤维蛋白膜板层的制备方法：取0.2μg凝血酶溶于100mL克隆培养液中作为A液；取250 mg牛血纤维蛋白原、800 mg NaCl、25 mg柠檬酸钠溶于1 000 mL重蒸水中作为B液。取B液1 mL和A液4 mL放入组织培养器皿内混合，几分钟之内便可形成透明胶层。
取对数生长期培养物用胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，用克隆培养液稀释细胞悬液，一般以每个培养皿可生长1～10个克隆的细胞浓度为最适。将细胞悬液按所需数目接种入铺有基质层的培养器皿内，置CO2培养箱内培养。每周更换培养液，几周后可见有由500～1 000个细胞形成的群落，检测并计克隆数目。
4）软琼脂克隆法
软琼脂层可帮助细胞贴附生长，但琼脂中含有酸性硫酸多糖，对多数细胞有一定的抑制作用。可是对有些细胞，特别是病毒转化细胞以及恶性转化细胞却无太大影响。因此，测试细胞能否在软琼脂层上生长，已成为检测恶性转化细胞的重要指标。操作方法：配制2%琼脂母液，经高压蒸气灭菌后储存备用。准备进行实验时，将2%琼脂母液加热熔化后自然降温，然后浸入45℃水浴中；将完全培养液也浸于45℃水浴中温育。取完全培养液和2%琼脂液配成0.33%琼脂的培养液，按每管2.5mL琼脂培养液分装入试管中，仍浸于45℃水浴中以保持琼脂呈液态待用。
用胰蛋白酶消化细胞，用克隆培养液逐级稀释细胞悬液，并将稀释悬液浸于冰浴中。分别在琼脂试管内加入含不同细胞浓度的细胞悬液0.5 mL，混合后立即倾入培养皿内铺平。放置于4℃使其凝固。然后置于CO2培养箱中培养，观察培养结果，计克隆数。
