9.3.3 克隆的分离
克隆形成后，需要将克隆分离出来进行培养。常用的分离方法有克隆环分离法、射线照射分离法和半固体培养基分离法。
1）克隆环分离法
克隆过程中形成的细胞群落在培养皿上分布不均，而且群落与群落之间没有天然界限。因此必须人为地给克隆群落创建一个隔离环境以便进一步分离。克隆环就是一种可以用来隔离克隆的工具。厚壁不锈钢环、尼龙或特氟隆塑料环等都可用作克隆环。克隆环底部必须光滑，内径可以恰好套进一个克隆，外径不接触到相邻的克隆。分离方法：取已形成克隆的培养皿，在显微镜下检查并将选择到的克隆做好标记，倒掉培养液。用镊子取一只已消毒过的克隆环，将其压到预先已倒入培养皿内灭过菌的硅润滑油上，使润滑油扩散到克隆环的底部。然后将浸有润滑油的克隆环放到选定的克隆上，将克隆套进去。借助硅润滑油和克隆环将克隆隔离。按同样方法将所有选中的克隆都分别套好。在每一个环内加满足够量的0.25%胰蛋白酶，停留20 s后将胰蛋白酶吸出，盖好器皿，37℃温育15 min。在每个环内加入足够的培养液，用弯头滴管吹打分散细胞。将细胞移入培养瓶内，注意每一个克隆用一只滴管，以免克隆间的交叉污染。再用新鲜培养液漂洗环内剩余细胞，合并放入同一培养瓶内。加入约1 mL培养液，维持培养瓶竖立培养。待细胞生长茂盛时去除培养液，用胰蛋白酶消化细胞。重新悬浮于5 mL培养液中，然后再将培养瓶平放，继续培养，如图9.6所示。
从克隆环内消化所得的细胞也可以用多孔板培养。将细胞接种入孔内，待细胞生长充满孔时，用胰蛋白酶消化细胞，并移入培养瓶内，加入约5 mL培养液，继续培养。
2）射线照射分离法(https://www.daowen.com)
在显微镜下检查克隆，将选中的克隆做好标记。将培养瓶倒置于X射线机下或钴-60源下，取一片2 mm厚的铅片盖住选中的克隆，用30 Gy照射。倒掉培养液，用胰蛋白酶消化细胞，加入新鲜培养液继续培养。此时，经射线照射过的细胞可作为饲养层存在。
3）半固体培养基分离法
取一块24孔培养板，每孔加入1 mL培养液。用毛细滴管的尖端插入半固体培养基内，并靠近选中的克隆，轻轻吸取群落。将吸取的群落转移到培养板的孔内，吸吹培养液，将克隆细胞冲入孔内，也可直接放入竖立的培养瓶内进行培养。待细胞生长满孔或者在竖立的培养瓶中生长茂盛后，用胰蛋白酶消化并移入培养瓶内平放继续培养。
图9.6 克隆环分离克隆操作示意图