12.3.1　胚胎干细胞的分离

12.3.1　胚胎干细胞的分离

1）普通分离方法

胚胎干细胞普通分离方法的步骤如下：

①将囊腔充分扩展的胚胎移到制备好的饲养单层上，换上胚胎干细胞培养液；或移至无饲养层但加有条件培养基的液滴内。

②继续培养。72 h透明带自行脱落；48 h后脱去饲养层的裸胚已经有内细胞团（ICM细胞）孵出，3～5天后将附着于培养瓶底的生长良好且未见分化的小鼠内细胞团用巴斯德吸管轻轻拨动使其与饲养层细胞分离，吸取内细胞团。

③在获得的内细胞团中加入适量的胰蛋白酶溶液消化处理，以含有胎牛血清的培养液终止消化，制成单细胞悬液，再分别移入新的饲养层细胞中或条件培养基中于37℃培养箱继续培养。

2）免疫外科法(https://www.daowen.com)

胚胎干细胞免疫外科法的步骤如下：

①将囊胚腔充分扩展、内细胞团明显的胚胎移至0.5%链霉蛋白酶液滴内，作用约5 min或采用显微注射法或自然培养法去除其透明带。

②用兔抗鼠脾脏细胞抗体处理无透明带胚胎20～30 min。用PBS洗涤胚胎3次。

③用新鲜豚鼠血清（补体）处理胚胎，溶解滋胚层细胞。层细胞膨大，呈透明空泡状即终止处理。用PBS洗涤胚胎3次。将胚胎移回培养液滴内，培养24 h。重新用兔抗鼠抗体和豚鼠血清处理胚胎，弃除残余的滋胚层细胞。

④将弃除滋胚层细胞的内细胞团移至培养液滴内继续培养。48～120 h后细胞团进一步增大。余下的操作同普通分离方法的步骤。