12.3.3 胚胎干细胞的鉴定
经分离培养所得到的细胞是否是所需的胚胎干细胞，应当进行细胞学的鉴定，干细胞在形态上与一般的细胞区别并不明显，常用的方法有分化实验、生化特性、核型分析等检测手段。
1）碱性磷酸酶的检测
如前所述，小鼠、大鼠的胚胎细胞均有碱性磷酸酶表达，因此碱性磷酸酶可以作为胚胎干细胞检测的生化指标。
将胚胎干细胞单细胞悬浮液种植到预先放置有盖玻片的培养皿内，经24 h培养后，弃上清，用PBS轻轻洗涤1～2次，再用4～8℃冷丙酮固定15min，弃冷丙酮固定液，再用PBS洗涤1次，立即送检或放入-30℃下保存，检测时把标本放入作用液中处理20 min，取出后用双蒸水清洗3次，再用甘油PBS封片。显微镜下检查，可见阳性细胞被染成棕色为胚胎干细胞。
作用液的配制：快绿5 mg，双蒸水0.08 mL，HCl（36%）0.02 mL，4%NaNO2 0.10 mL，萘酚AS-TR磷酸钠10mg，DMSO 0.5mL，PBS（pH为8.6）5mL，10%MgCl2 0.05mL，以1mol NaOH将pH调至8.4。
2）核型分析
核型分析是一种检测细胞的有效方法，通过对染色体形态数目的分析可以了解细胞的特征和生长状况，并与异常或畸形细胞相鉴别。
方法：取培养好的胚胎干细胞，加入胰蛋白酶消化处理制成单细胞悬浮液。加秋水仙素处理（最终浓度0.08μg／mL）2 h，弃去上清液，使细胞停止于分裂中期。用0.075 mol／L氯化钾37℃低渗处理15 min后低速离心。在沉淀中加入新配制的3∶1冰乙酸甲醇固定液处理15 min，并注意间断震荡以使固定均匀。为了提高染色体的质量，细胞低渗处理后固定时间一定要充分，有助于除去中期分裂相中残存的蛋白质，使染色体更清晰，随后将固定好的细胞吹散制成干细胞悬液。取干净无油的载玻片保存于4℃中备用，这样可使载玻片表面附上一层水膜，细胞悬液遇到载破片上的冷水，染色体能迅速分散开。将细胞悬液滴于准备好的载玻片上，75℃烘烤2 h。2.5 g／L胰蛋白酶消化50 s后加入5%Giemsa染色5min，冲洗除去残液，晾干后于油镜下观察，可分析100个细胞染色体，观察整倍体数目，计算出整倍体百分比，同时用图像分析仪进行染色体扫描。
3）胚胎干细胞分化检测实验(https://www.daowen.com)
胚胎干细胞源于由囊胚中的内细胞团（ICM），具有多向分化的潜能，可以发育为多种细胞系，因此可以通过体内体外实验以及干细胞分化特性来对其进行检测。
（1）体内实验
收集胚胎干细胞，用注射器吸取干细胞悬液将胚胎干细胞接种于BAIB／c小鼠或BAIB／c裸小鼠腹股沟皮下。将接种细胞后的小鼠放回饲养。隔3～4天观察小鼠成瘤情况。待肿瘤长至1mm3大小处死小鼠，取出肿块，用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜检查细胞分化情况。
（2）体外实验
体外实验应用较多，其基本过程是将培养好的胚胎干细胞悬浮液离心收集，用含葡萄糖的DMEM添加胎牛血清继续培养。将胚胎干细胞悬浮液接种培养于未经明胶处理的培养瓶内，注意每天摇晃培养瓶以防止细胞和克隆贴壁。几天后观察便可发现形成简单的类胚胎、随后出现典型的囊状胚胎，这时可将囊状小体取出，进行组织学检查鉴定。
（3）嵌合体实验（显微注射法）
嵌合体实验是验证胚胎干细胞全能性的重要实验，即胚胎干细胞与正常的胚胎联合。如能产生包括生殖器在内的各个组织器官，并且能产生功能性配子的嵌合体，即可证实分离得到的细胞是具有全能性的胚胎干细胞。一般采用显微注射法，即将胚胎干细胞注射到囊胚中，再将囊胚植入子宫内，使其发育为嵌合体，随后可根据观察新生小鼠的毛发颜色来进一步鉴定嵌合鼠。
（4）核移植实验
首先用灰色的小鼠品系进行雌雄交配，从母体的子宫内获得囊胚细胞，囊胚细胞可发育成胚胎，用极细的吸管取出内细胞团细胞的细胞核，并将其注射到刚受精的、但卵核与精核尚未融合的黑色小鼠的受精卵中，并将黑色小鼠受精卵原有的卵核和精核吸出，将处理过的受精卵体外培养到胚盘细胞期，再将它移植到母鼠的子宫内，让其继续发育，产生的新生小鼠必然会长出灰色的毛。
