12.3.2 胚胎干细胞的培养
体外培养胚胎干细胞的基本原则是，在促进胚胎干细胞增殖的同时，维持其未分化的二倍体状态，胚胎干细胞一旦分化即失去其全能性。目前，体外培养胚胎干细胞的方法归纳起来有饲养层培养法、无饲养层培养法和已建系的胚胎干细胞体外培养法3种。
1）胚胎干细胞有饲养层培养
①饲养单层细胞制备。饲养细胞要求每周制备一次，作为未分化胚胎干细胞的基底细胞，为避免其增殖超过胚胎干细胞，必须使其停止增殖制备成饲养单层。最常用的方法是加入丝裂霉素C抑制细胞的有丝分裂，使细胞停止生长又具有营养作用。在此以MEF（Mouse Embryonic Fibroblast，小鼠胚胎成纤维细胞）为例简单介绍制备过程：在生长良好的MEF细胞中加入新配制的含丝裂霉素C（10μg／mL）的MEF生长培养基，37℃孵育2～5 h；同时将1 g／L明胶水溶液加入培养皿内，覆盖培养皿表面，在室温下静置2 h以上，使用前，吸弃多余的明胶水溶液，PBS洗涤1次；去掉培养基，10mL PBS冲洗3次，完全除去丝裂霉素，加10 mL胰蛋白酶-EDTA溶液，在37℃条件下孵育5 min后加入MEF生长培养基，用吸管吹散细胞，并转移至15 mL离心管；离心收集细胞，计数细胞；将丝裂霉素处理的MEF细胞以7.5×104～1×105个／cm2接种于明胶包被的培养皿中，37℃5%CO2培养。待细胞贴壁后进行观察。若发现细胞过稀，需补加处理过的细胞，以保证细胞能连成一片而没有间隙。将制备的饲养单层放置在培养箱中备用。在5天内使用，使用前要更换成胚胎干细胞培养液。
②将分散的胚胎内细胞团小块吸至饲养层上。一孔放置一个内细胞团的细胞，在37℃5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。每天观察。2天后，见胚胎干细胞小集落出现；3～4天集落进一步增大；6～10天，可进行消化传代。
③消化时，弃培养液，用PBS洗涤1次。加入消化液，消化30 s后弃消化液，让残余的消化液继续作用。当饲养层细胞单层出现裂隙时，加入培养液终止消化，或在倒置显微镜下观察，见细胞与细胞之间分开即加入培养液终止消化。
④添加适量的培养液，轻轻吹打，使其成单细胞悬液。接种到新的饲养层上进行扩大培养。
2）胚胎干细胞无饲养层培养(https://www.daowen.com)
①用0.1%明胶水溶液包被培养板各孔。往培养孔内加入条件培养基，每孔1 mL。
②将分散的胚胎内细胞团小块吸至培养孔内，一孔放置一个内细胞团的细胞。在37℃5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。6～10天，进行消化传代。单细胞悬液加入条件培养基进行扩大培养。
3）已建系的胚胎干细胞体外培养
（1）有饲养层培养
制备饲养单层，将已培养2～3天，生长旺盛的胚胎干细胞克隆消化成单细胞悬液。消化方法同前。添加胚胎干细胞培养液，以1∶3～1∶6比例转种到新的饲养单层上。在37℃5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。
（2）无饲养层培养
用明胶预先包被培养瓶，将已培养2～3天，生长旺盛的胚胎干细胞克隆消化成单细胞悬液。消化方法同前。添加胚胎干细胞培养液，以1∶3～1∶6比例转种到新用明胶预先处理过的培养瓶内。在37℃5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。
