实训1 器械的清洗与消毒
【实训目的】
1.了解各种洗涤液的特性。
2.掌握酸液的配制方法和细胞培养使用的器皿、器械的洗涤和消毒。
【实训原理】
由于细胞培养过程中器皿的重复利用，特别是培养基中有机物质及培养组织分泌物的附着，影响再次培养，导致实验结果发生误差，甚至使培养细胞受到毒害。同时，一些新制玻璃器皿，部分地存在碱性游离物，从而影响到实验结果的准确性。因此，新的或重新使用的器皿都必须认真清洗，使其达到不留任何残留物的要求。因不同培养器皿的材料、结构、使用方法不同，清洗的方法也不同。
【试剂与主要用品】
1.仪器用具：毛刷、塑料盆、天平、量筒、烧杯、洗耳球、洗刷装置（全自动洗涤机）、高压灭菌器、耐酸手套、玻璃棒、需洗涤器皿等。
2.试剂：肥皂粉、洗衣粉、去污粉、洗洁精、重铬酸钾、浓硫酸、蒸馏水、纯乙醇或95%的乙醇等。
【操作步骤】
（一）清洗
1）玻璃器皿的洗涤（酸洗）
玻璃器皿的洗涤一般要经过浸泡、刷洗、浸酸和清洗4个步骤。
（1）浸泡
新的或用过的玻璃器皿都需要先用清水浸泡，以软化和溶解附着物。新购置的玻璃器皿含有游离碱，应先用自来水简单冲洗，再用1%～5%HCl浸泡过夜；用过的玻璃器皿往往附着有大量有机物质及培养组织的分泌物，干涸后不易涮洗掉，故用后应立即浸入清水中以备刷洗；被杂菌污染的培养瓶或培养皿等玻璃器皿，应先高压灭菌20 min，倒掉污染的培养基后，再浸入清水中浸泡以备刷洗。
（2）刷洗
将浸泡后的玻璃器皿放入肥皂液或洗衣粉液中，用毛刷反复刷洗，刷洗中要不留死角，并防止破坏玻璃表面的光洁度。将刷洗过的玻璃器皿冲洗干净、晾干，准备浸酸。
（3）浸酸
将上述玻璃器皿浸泡到重铬酸钾洗涤液（又称酸液）中，通过酸液的强氧化作用清除器皿表面残留的物质。根据洗涤液中含硫酸的比例，将洗涤液分为强酸、次强酸和弱酸3种。根据需要配制洗涤液，洗涤液对玻璃无腐蚀作用，去污效果好。重铬酸钾洗涤液的配方，见表13.1。
表13.1 重铬酸钾洗涤液的配方
配制重铬酸钾洗涤液时，操作者必须小心认真，戴耐酸手套和防护眼镜，并严格按下列方法进行：
①按配方称量好重铬酸钾和蒸馏水，然后将重铬酸钾完全溶于蒸馏水中（可加热）。
②按配方把工业用浓硫酸缓慢（以产热很少为宜）加入冷却的①中，边加边搅拌。
③自然冷却、备用。洗涤液为强氧化剂，去污力强，可以洗去玻璃器皿或瓷质器皿上的有机物，切不可洗涤金属器皿。配制、盛装洗涤液的容器应防酸、耐热、有较大的开口，一般用瓷缸、玻璃制品或耐酸塑料制品。洗涤液在使用过程中和使用后都应保持密闭，防止氧化变质。新配制的洗涤液呈棕红色，当使用时间过久，洗涤液的颜色变暗、发绿或浑浊时，应弃去（深埋地下），重新配制新的洗涤液。
一般来说，新的和用过的玻璃器皿都应浸酸，那些无法用毛刷刷洗的用品（如吸管、滴管等）更要靠浸酸去除污物。浸酸时，器皿应完全被洗涤液充满和覆盖。浸酸时间不少于6 h，一般要过夜或更长时间。将器皿放入洗涤液时，应小心操作，防止伤及皮肤、眼睛或衣服。从洗涤液中取出器皿时，应沥干洗涤液，并将浸酸的器皿放入合适的容器中，如塑料盆中运输。(https://www.daowen.com)
（4）冲洗
刷洗和浸酸后的器皿都必须用水充分冲洗，浸酸后器皿是否冲洗得干净，直接影响到组织培养的成败。冲洗可用洗涤装置，也可手工操作。手工洗涤浸酸后的器皿时，每件器皿都至少要重复“注满水—倒空”15次以上，最后用蒸馏水浸洗2～3次，晾干或烘干后包装备用。
载玻片与盖玻片的洗涤：先用流水冲洗，再将其浸入含有1%～2%盐酸的95%乙醇液中浸泡6～12 h，流水冲洗后再浸入加了1～2滴氨水的80%乙醇中1 h，取出后用绸布擦干，保存在载玻片盒或培养皿中备用。
2）橡胶制品的清洗
新购置的橡胶制品（如胶管、胶塞、橡皮乳头等）的洗涤方法：0.5mol／L NaOH煮沸15min→流水冲洗→0.5 mol／L HCl煮沸15 min→流水冲洗→自来水煮沸2次→蒸馏水煮沸20 min→50℃烘干备用。用过胶塞的洗涤方法基本同玻璃器皿，但胶塞洗刷的重点部位是胶塞使用面，应逐个刷洗。
3）塑料制品的清洗
塑料制品的特点：质地软，易出现划痕；耐腐蚀能力强，但不耐热。其清洗程序：使用器皿后立即用流水冲洗→浸于自来水中过夜→用纱布或棉签蘸50℃洗涤液的刷洗→流水冲洗→晾干→浸于洗涤液中15 min→流水冲洗15～20遍→蒸馏水浸洗3次→晾干备用。
4）金属器械的清洗
新购置的金属器械常涂有防锈油，先用蘸有汽油的纱布擦去油脂，再用水洗净，最后用酒精棉球擦拭，晾干。用过的金属器械先用清水煮沸消毒，再擦拭干净，使用前以蒸馏水煮沸10 min，或包装好以101.3 kPa高压灭菌15 min。
5）除菌滤器的清洁
用过的滤器将滤膜去除，用三蒸水充分洗净残余液体，置于干燥箱中烘干备用。
（二）包装
包装的目的是防止消毒灭菌后再次被污染。经清洗烤干或晾干的器材，应严格包装后再进行消毒灭菌处理。包装材料常用牛皮纸、硫酸纸、专用包装纸棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳、胶皮套等。包装分为全包装和局部包装，全包装适于较小的培养瓶（皿）、吸管、注射器、金属器械和胶塞等。
（三）消毒灭菌
1）干热灭菌
玻璃器皿，160～170℃90～120 min，或180℃45～60 min。
2）高压蒸气灭菌
用于玻璃器皿、滤器、橡胶塞、解剖用具、耐热塑料器具、受热不变性的溶液等。不同物品的有效灭菌压力和时间不同。通常培养用液、橡胶制品、塑料器皿等用65 kPa（115℃）高压灭菌10 min，布类、玻璃制品、金属器械等用101.3 kPa（121℃）高压灭菌15～25 min。
3）紫外线
紫外线的波长为200～300 nm，最强为254 nm，高度2.5 m以下，湿度45%～60%，杆菌效果好，球菌次之，霉菌和酵母菌最差，实验前应不低于30 min的照射时间。
4）化学消毒
采用化学药品来杀死微生物。常用的有消毒酒精、升汞、甲醛等。
【结果与讨论】
1.各种培养容器、器皿洗涤方法有何不同？
2.请分析不同的消毒灭菌方法分别适合什么物品和场所。
