实训2　细胞培养液的配制（母液的配制、培养基的制备与灭菌）

实训2　细胞培养液的配制（母液的配制、培养基的制备与灭菌）

【实训目的】

1.学会植物组织培养基母液的配制。

2.掌握培养基的制备与灭菌。

【实训原理】

植物培养基是植物离体培养组织或细胞赖以生存的营养基质，是为离体培养材料提供近似活体生存的营养环境，主要包括水、大量元素、微量元素、铁盐、有机复合物、糖、凝固剂和植物生长调节物质。

在配制培养基前，为了使用方便和用量准确，常常将培养基成分首先配制成比实际培养基浓度大若干倍的母液，然后在配制培养基时，再根据所需浓度按比例稀释。本实训以MS培养基为例，学习培养基母液的配制、培养基的制备和灭菌。

【试剂与主要用品】

1.仪器用具：分析天平（感量0.01 g和0.000 1 g）、药匙、玻璃棒、称量纸、吸水纸、滴管、洗瓶、标签纸、烧杯（50、100、200 mL）、容量瓶（100、200、500、1 000 mL）、试剂瓶（100、200、500、1 000 mL）、量杯、量筒、移液管、洗耳球、电炉等。

2.试剂：95%乙醇、1 mol／L NaOH、1 mol／L HCl；MS培养基各成分试剂；植物生长调节剂（2，4-D、6-BA、IAA、NAA等）；洗涤剂。

【操作步骤】

（一）母液配制

1）大量元素母液的配制

按照培养基配方的用量，把各种化合物扩大10倍，按照表13.2中的次序分别准确称量后，分别用50 mL烧杯，加入蒸馏水30 mL溶解（可加热至60～70℃，促其溶解）。溶解后，按顺序倒入一大烧杯中（烧杯中事先加入约50 mL的蒸馏水，目的是避免由于盐浓度过高而使钙离子与磷酸根离子、硫酸根离子形成不溶于水的沉淀），注意最后加入氯化钙溶液，混匀，用250 mL容量瓶定容。将配制好的母液倒入试剂瓶中，贴好标签，保存于4℃冰箱中待用。

2）微量元素母液的配制

按照培养基配方的用量，将微量元素各种化合物（除去铁盐）扩大100倍，见表13.3，用感量为0.000 1 g分析天平分别准确称取，可以混合溶解，最后定容。将配制好的母液倒入试剂瓶中，贴好标签，于4℃保存。

表13.2　MS培养基大量元素母液（10倍）的配制剂量

表13.3　MS培养基微量元素母液（100倍）的配制剂量

3）铁盐母液的配制

常用的铁盐是FeSO4·7H2O和Na2-EDTA的螯合物，必须单独配成母液。配制时，按照扩大后的用量，见表13.4，分别称取FeSO4·7H2O和Na2-EDTA并分别溶解后，将FeSO4溶液缓缓倒入Na2-EDTA溶液（需加热溶解），搅拌均匀使其充分螯合，定容后贮放于棕色玻璃瓶内，并保存于冰箱中。

表13.4　MS培养基铁盐母液（100倍）的配制剂量

4）有机物母液的配制

按照表13.5中各成分浓度扩大后的用量，用感量为0.000 1 g分析天平分别称量各有机物。可以分别溶解定容并分别装入试剂瓶中，也可以混合溶解定容，装入同一试剂瓶中，写好标签，放入冰箱中保存。一般有机物都溶于水，但叶酸则先用少量稀氨水或1 mol／L NaOH溶液溶解；维生素H先用1 mol／L NaOH溶液溶解；维生素A、维生素D3、维生素B12应先用95%乙醇溶解，然后再用蒸馏水定容。

表13.5　MS培养基有机物母液（100倍）的配制剂量(https://www.daowen.com)

注：表中各成分的扩大倍数与称取量仅是举例，可以根据实际需要而确定扩大倍数以及计算实际称取量。

5）激素母液的配制

激素母液必须分别配制，浓度根据培养基配方的需要量灵活确定，一般为0.1～2 mg／mL，根据需要确定配制的浓度。称量激素要用感量为0.000 1 g分析天平。配制激素母液时应注意，各激素的溶剂不同，具体见表13.6。

表13.6　植物组织培养中常用植物激素及生长调节物质的溶剂

注：称取10 mg NAA溶解后定容至100m L，即得到0.1 mg／mL NAA贮备液。
称取100 mg 6-BA溶解后定容至100 mL，即得到1 mg／mL 6-BA贮备液。

6）在配制母液时注意事项

①培养基各试剂应使用分析纯。

②在称量时应防止药品间的污染，药匙、称量纸不能混用，每种试剂使用一把药匙，多出的试剂原则上不能再倒回原试剂瓶。

③母液配制好后，贴上标签，写清母液名称、试剂浓度或扩大倍数、配制日期，并存放在4℃冰箱中。使用前，要进行检查，若发现试剂中有絮状沉淀、或长菌、或铁盐母液的颜色变为棕褐色，都不应再使用。

（二）植物组织MS培养基的配制

1）计算母液使用量

略。

2）配制

用量筒量取870 mL［870 mL＝1 000 mL-100 mL（大量元素母液）-10 mL（微量元素母液）-10 mL（铁盐母液）-10 mL（有机物母液）］蒸馏水加入烧杯，称取琼脂7 g、蔗糖20 g，加入烧杯，在电炉上加热、煮沸，使琼脂熔化。等琼脂完全熔化后，加入上述各种母液。

3）激素母液添加

计算不同激素母液的需要量，加入培养基中。

4）pH调节

待温度降至50～60℃时，用1mol／L NaOH溶液或1mol／L HCl溶液调pH值至5.8，注意用玻璃棒不断搅动，用pH试纸或酸度计测试pH。调节中，若加1滴1mol／L HCl或NaOH溶液，pH改变量出现超过需要值的现象，应改用低浓度HCl或NaOH溶液（如0.1 mol／L调节pH）。

5）分装

搅匀培养基并迅速分装在100 mL的三角瓶中（温度低于40℃以下琼脂就会凝固），每瓶25 mL左右，1 000 mL培养基可以分装至40～50瓶，迅速扎好瓶口，写上标记。

配制好的培养基需要进行高压灭菌后，方可使用。

【结果与讨论】

观察培养基制备过程中出现的现象并加以解释。