实训10　磷酸钙沉淀法介导细胞转染

实训10　磷酸钙沉淀法介导细胞转染

【实训目的】

1.了解细胞转染技术原理和基本方法。

2.磷酸钙沉淀法的基本技术要点。

【实训原理】

磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA复合物的一种将DNA导入真核细胞的转染方法，磷酸钙被认为有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。磷酸钙-DNA复合物黏附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞，被转染的DNA可以整合到靶细胞的染色体中从而产生有不同基因型和表型的稳定克隆。这种方法首先由Graham和Van der Ebb使用，后由Wigler修改而成。可广泛用于转染许多不同类型的细胞，不但适用于短暂表达，也可生成稳定的转化产物。

【试剂与主要用品】

1.仪器用具：37℃，5%CO2培养箱、100 mm组织培养平板、15 mL锥形管。

2.试剂：2×HEPES缓冲盐水［（HEPES，pH为6.95～7.05）：50.0 mmol／L HEPES、280 mmol／L NaCl、10 mmol／L KCl、1.5 mmol／L葡萄糖，用0.5 mmol／L NaOH调pH至6.95～7.05，过滤除菌后，-20℃保存备用）］；2.5mol／L CaCl2过滤除菌（20℃保存备用）；磷酸缓冲盐液（PBS）；完全培养液（根据所用的细胞系而定）；呈指数生长的真核细胞（如HeLa、BALB／c 3T3、NIH 3T3、CHO或鼠胚胎成纤维细胞）；CsCl纯化的质粒DNA（10～50μg／次转染，二次纯化）。

【操作步骤】

具体操作步骤如下：(https://www.daowen.com)

①传代细胞准备。细胞在转染24 h传代，待细胞密度达50%～60%满底时，即可进行转染。加入沉淀前3～4 h，用9 mL完全培养液培养细胞。

②DNA沉淀液的准备。首先将质粒DNA用乙醇沉淀（10～50μg／10 cm平板），空气中晾干沉淀，将DNA沉淀重悬于50μL无菌水中，加50μL 2.5 mol／L CaCl2。

③用巴斯德吸管在500μL 2×HEPES中逐滴加入DNA-CaCl2溶液，同时用另一吸管吹打溶液，直至DNA-CaCl2溶液滴完，整个过程需缓慢进行，至少需持续1～2 min。

④室温静置30 min，出现细小颗粒沉淀。

⑤将沉淀逐滴均匀加入10 cm平板中，轻轻晃动。

⑥在标准生长条件下培养细胞4～16 h。除去培养液，用5 mL 1×HEPES洗细胞2次，加入10 mL完全培养液培养细胞。

⑦收集细胞或分入培养皿中选择培养。

⑧6～7天后挑选阳性克隆。

【结果与讨论】

完成磷酸钙转染细胞的操作步骤、转染结果及分析。