实训9　MDCK细胞的冷冻与复苏

实训9　MDCK细胞的冷冻与复苏

【实训目的】

了解体外培养细胞冻存、复苏的基本操作方法。

【实训原理】

细胞在长期传代过程中，可能会出现微生物污染或突变等情况，导致优良基因丢失。为防止这些细胞的丢失，可将细胞快速冷冻并保存在非常低的温度下。但是，当温度低于0℃时，细胞内外的水分会结冰，导致细胞膜和细胞器受到严重损伤。因此要维持冷冻和复苏过程中细胞的存活率，必须在冷冻液中加入冷冻保护剂。常用的冷冻保护剂有二甲基亚砜（DMSO）和甘油，其中二甲基亚砜因为其对细胞具有良好的保护性和较低的毒副作用而成为首选。在冷冻和复苏过程中影响细胞存活率的因素主要是保护剂浓度和温度下降速率，实际操作中二甲基亚砜的浓度通常为5%～10%，一般来说，冷冻过程中温度必须缓慢下降，尽可能减少细胞内冰晶的形成；在复苏过程中对细胞产生伤害的原因主要是解冻过程所形成的局部渗透压波动，通常采用的方法是快速解冻。

【试剂与主要用品】

1.仪器用具：程序降温仪、超净工作台、离心机、液氮罐、冻存管（无菌）、离心管、方瓶、移液管、培养基等。

2.试剂：冻存液（10%DMSO+10%小牛血清+80%培养液）。

【操作步骤】

具体操作步骤如下：

1）冷冻过程

①准备好分散良好的MDCK细胞悬浮液并用台盼蓝染色计数。

②离心并将MDCK细胞重新悬浮在冻存液中，使细胞密度达到活细胞6×106／mL。

③将MDCK细胞分装在冻存管中，每支1 mL，旋紧冻存管盖子。(https://www.daowen.com)

④静置30 min，使冻存液和细胞内的DMSO浓度达到平衡。

⑤将冻存管置于程序降温仪内，设置降温速率1℃／min，-40℃后5℃／min，降温至-100℃停止。

⑥将冻存管置于液氮罐（-196℃），长期保存。

⑦在记录本上做好冻存记录，记录内容包括冻存日期、细胞名、冻存管数、冻存过程中降温的情况、冻存位置以及操作人员。

2）复苏过程

①准备好玻璃方瓶、移液管、离心管（无菌）、新鲜培养基等。

②将冻存管从液氮罐中取出，立即置于37℃水浴中，直至冻存管内MDCK细胞悬浮液完全融解，此过程为1～2 min。

③在超净工作台内将冻存管内MDCK细胞悬浮液移至离心管，加入10 mL新鲜培养基，离心（5 min 1 500 r／min）；倒掉上清液，将MDCK细胞重新悬浮于10 mL新鲜培养基中，移至玻璃方瓶，置于二氧化碳培养箱。

④24 h后，经培养瓶从二氧化碳培养箱取出，洗掉培养液，加入2 mL PBS，轻轻摇晃，吸出，重复一次，加入新鲜培养液，送回二氧化碳培养箱继续培养。

⑤用倒置显微镜检查细胞存活率及细胞密度，若细胞密度过高，应及时传代。

【结果与讨论】

进行细胞冻存时，为什么选择对数生长期的细胞？