实训8　MDCK细胞（犬肾细胞）的传代培养

实训8　MDCK细胞（犬肾细胞）的传代培养

【实训目的】

学习动物细胞的传代培养法。

【实训原理】

细胞培养分原代和传代培养。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长，这一过程称为传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。

【试剂与主要用品】

1.仪器用具：CO2培养箱、倒置显微镜、超净台、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯、细胞。

2.试剂：MEM细胞生长液［500 mLMEM液+5mL双抗（青霉素+链霉素）+5mL L-谷氨酰胺+7.5 mL碳酸氢钠+50 mL小牛血清］、90%MEM液、1%双抗、1%L-谷氨酰胺、1.5%碳酸氢钠、10%小牛血清、0.25%EDTA胰酶（从冰箱取出后放入培养箱中待用）、Hanks液。

【操作步骤】

具体操作步骤如下：

①进入无菌室之前用肥皂洗手，用75%酒精擦拭消毒双手。

②倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置37℃下预热。(https://www.daowen.com)

③超净台台面应整洁，用75%酒精溶液擦净。

④打开超净台的紫外灯照射台面20 min左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气。

⑤点燃酒精灯，取出无菌试管，刻度吸管；安上橡皮头；插在无菌试管内。

⑥打开细胞培养瓶，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。

⑦倒掉培养细胞的旧培养基。酌情可用2～3 mL Hanks液洗去残留的旧培养基，或用少量胰酶涮洗一下。

⑧加入胰酶消化液，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。注意勿使细胞提早脱落入消化液。

⑨加入少量的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基（大瓶7～10mL，小瓶3～5mL）制成细胞悬液，分装到新培养瓶中。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。

⑩对悬浮培养细胞，步骤⑦～⑨不做。可将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。

【结果与讨论】

1.试述传代培养的步骤和注意事项，并指出关键步骤。

2.细胞传代培养的目的是什么？