2.2.2　DNA连接酶的种类

DNA连接酶形成共价键的连接反应需要提供能量，依据反应时所需能量辅助因子不同分为两类：一类是依赖ATP的DNA连接酶；另一类是依赖NAD+的DNA连接酶。依据其来源，可分为三类：T4DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶和热稳定DNA连接酶。

1.T4DNA连接酶

T4DNA连接酶（T4DNA ligase）由T4噬菌体30基因编码，相对分子质量为60000，是基因工程广泛使用的连接酶。反应需要ATP提供能量。T4DNA连接酶可以催化DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA和双链DNA黏性末端或平末端之间的连接反应，但平末端之间的连接效率较低。反应体系中加入低浓度的聚乙二醇（一般为10％）和单价阳离子（150～200 mmol/L NaCl），或者适当提高酶量和底物浓度均可以提高平末端连接效率。

2.大肠杆菌DNA连接酶

大肠杆菌DNA连接酶（E.coli DNA ligase）相对分子质量为74000，由lig基因编码。与T4 DNA连接酶不同，反应需要的不是ATP，而是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）作为能源辅助因子，且其平末端连接效率要远远低于T4 DNA连接酶，不能连接RNA分子。在分子克隆实验中不常用该连接酶。

3.热稳定DNA连接酶

热稳定DNA连接酶（thermostable　DNA ligase），是从嗜热高温放线菌（Thermoactinomyces thermophilus）中分离得到的，它能够在高温下催化两条寡核苷酸探针的连接反应。热稳定DNA连接酶以NAD+为辅助因子，经过多次热循环后依然保持活性，因此被广泛应用于检测哺乳类DNA突变的扩增反应中。