2.2.4　平末端DNA片段的连接

2.2.4　平末端DNA片段的连接

如果限制性核酸内切酶切割后产生的是平末端的DNA片段，那么不管是用何种限制性核酸内切酶切割，也不管是用何种方法产生的，都可以通过T4DNA连接酶进行连接。由于平末端DNA分子间的连接属于分子间的反应，其连接效率只有黏性末端的1％～10％。一般在连接反应体系中通过加入高浓度的T4DNA连接酶，使之达到黏性末端连接酶浓度的10倍；增加平末端DNA的浓度，以提高平末端之间的碰撞概率；选择适当的反应温度（一般为2025℃），促进DNA平末端之间的碰撞，增加连接酶的反应活性；加入低浓度的聚乙二醇，促进DNA分子凝聚，提高连接效率等措施来提高平末端之间的连接效率。

尽管如此，平末端连接还是存在一些缺陷：①连接效率低；②黏性末端补平或切平的平末端常常破坏限制性核酸内切酶原有的识别序列；③平末端外源DNA在载体中可以双向插入；④在较高底物浓度下，可产生多拷贝外源DNA片段插入载体。为了克服以上缺陷，对平末端的连接通常采用同聚物加尾法、衔接物连接法及DNA接头连接法等方法。

1.同聚物加尾法

末端脱氧核苷酸转移酶是从动物组织中分离出来的一种异常的DNA聚合酶，它能够将核苷酸（通过脱氧核苷三磷酸前体）加到DNA分子单链延伸末端的3'-OH基团上。同聚物加尾法就是利用末端脱氧核苷酸转移酶转移核苷酸的这种特殊功能，在载体分子和外源双链DNA 3'-OH末端加上互补同聚物尾巴，从而形成同聚物黏性末端，载体和外源DNA分子通过同聚尾之间的碱基互补，可以相互连接起来形成重组DNA分子。通过DNA片段加尾，既可以使两个平末端的DNA片段进行连接，也可以使平末端的DNA片段与黏性末端的DNA片段进行连接（图2-6）。

在实际实验过程中，两个DNA分子加的同聚物尾巴并不总是一样长，这样形成的重组DNA分子上便会留有缺口或间断。但这种修复反应不一定要在体外完成，如果互补的一对同聚物尾巴长度超过20 nt，它们结合形成的碱基对结构是相当稳定的，这种未经完全连接的重组DNA分子可直接转入受体细胞，由受体细胞内部的DNA聚合酶和DNA连接酶完成对它的修复。

同聚物加尾法是一种十分有用的DNA分子连接法，任何一种方法制备的DNA片段都可以用这种方法进行连接，载体和外源片段的互补黏性末端连接效率较高，而且不存在自身环化现象。但也有不足之处：①方法烦琐；②外源片段难以回收；③由于添加了同聚物尾巴，可能影响外源基因的表达。此外，同平末端连接法一样，重组连接后往往产生某种新的限制酶切位点。

2.衔接物连接法

在重组DNA的研究工作中，为了深入研究，往往需要从重组体DNA分子上分离出克隆的DNA片段。如果重组DNA是用T4DNA连接酶的平末端连接法或是同聚物加尾法构建的，就无法用原来的限制性核酸内切酶进行特异性切割，因此也无法获得插入的外源DNA片段。为了克服这种缺陷，可以采用加衔接物的方法提供必要的序列，进行DNA分子的连接。

所谓衔接物，是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸组成、具有一个或数个限制性核酸内切酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。衔接物的5'末端和待克隆的DNA片段的5'末端，用多聚核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后再通过T4DNA连接酶的作用使两者连接起来。接着用适当的限制性核酸内切酶消化具有衔接物的DNA分子和克隆载体分子，这样使两者产生彼此互补的黏性末端。于是可以按照常规的黏性末端连接法，将待克隆的DNA片段同载体分子连接起来。此方法适用于没有衔接物限制性核酸内切酶位点的外源DNA片段（图2-7）。

衔接物可以在实验室用化学方法合成，也可以外购。厂商提供的衔接物有磷酸化和非磷酸化两种形式，后者在使用前需要用多聚核苷酸激酶处理才能成为连接酶的合适底物。

衔接物连接法是进行DNA重组的一种既有效又实用的手段，兼具同聚物加尾法和黏性末端法的优点，可以说是一种综合的方法。在实际操作中，可以根据具体情况设计具有不同限制性核酸内切酶识别位点的衔接物，使不同末端的DNA片段连接起来。但是此方法也有不足之处，即如果待克隆的DNA片段或基因的内部也含有与所加衔接物相同的限制位点，这样在酶切消化衔接物产生黏性末端的同时，也就会把外源基因切成不同的片段，给后续的亚克隆造成困难。

3.DNA接头连接法

对于不易连接的DNA片段，采用人工合成的接头进行连接是比较有效的。DNA接头是一类人工合成的一端具有某种限制性核酸内切酶黏性末端，另一端为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。图2-8所示为一种具有BamH Ⅰ黏性末端的典型的DNA接头分子。当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，便会使后者成为具有黏性末端的新的DNA分子而易于连接重组。但实际使用时为了避免DNA接头通过互补碱基间的配对作用，形成如同DNA衔接物一样的二聚体分子，需要对DNA接头末端的化学结构进行必要的修饰与改造，以避免处在同一反应体系中的各个DNA接头分子的黏性末端之间发生配对连接。通常将人工接头黏性末端的5'-P去除，暴露出5'-OH，使得DNA连接酶无法在5'-OH和3'-OH之间形成磷酸二酯键，不会产生稳定的二聚体分子。

这种黏性末端被修饰的DNA接头分子，虽然丧失了彼此连接的能力，但其平末端仍然可以与平末端的外源DNA片段连接。需要注意的是，在连接之后，要用多聚核苷酸激酶使5'-OH末端恢复成正常的5'-P末端，使其可以插入适当的克隆载体分子。