2.1.5　限制性核酸内切酶切割DNA的方法

限制性核酸内切酶切割DNA的常用方法有单酶切、双酶切和部分酶切。

1.单酶切

单酶切是指用一种限制性核酸内切酶切割DNA样品，这是DNA片段化最常用的方法。如果DNA样品是环状DNA分子，产生的DNA片段数与识别位点数（n）相同，并且DNA片段的两个末端是相同的。如果样品是线状DNA分子，产生的DNA片段数为n+1，其中有两个片段的一端仍保留原来的末端。

2.双酶切

双酶切是指用两种不同的限制性核酸内切酶切割同一种DNA分子，从而产生的DNA分子片段带有两个不同的末端，这是实验操作中常用的手段之一。如果载体分子也用同样的两种酶切割，那么可以把外源DNA酶切片段定向地插入载体分子中，实现基因重组。

使用两种酶同时进行DNA切割反应时，为了节省反应时间，通常希望在同一反应体系内进行同步酶切，这时要求酶的反应缓冲液和反应温度是相同的。商品化的限制性核酸内切酶有很多是在几种缓冲液中都具有很高的内切酶活性，因此，在实际操作中，可以选择使所用的两种限制性核酸内切酶都具有活性的缓冲液或通用缓冲液来进行酶切反应。

在很多情况下，两种限制性核酸内切酶的反应条件不一样，这就需要分步酶切。如果两种限制性核酸内切酶的反应温度不同，则先用反应温度较低的酶进行切割，升温后再加入第二种酶进行切割。如果两种限制性核酸内切酶的反应体系不同，则可在第一种酶切割后，经过凝胶电泳回收需要的DNA片段，再选用合适的反应体系，进行第二种限制性核酸内切酶的切割。如果两种限制性核酸内切酶要求的盐浓度不同，当两种酶对于盐浓度要求不大时（如一种酶属于中盐组，另一种酶属于高盐组），可同时进行酶切反应，只是选择对价格较贵的酶有利的盐浓度，而另一种酶可以通过加大酶量的方法来弥补因盐浓度不合适所造成的活性损失。当两种酶对于盐浓度要求差别较大时，则不适宜同时进行酶切反应，可考虑选用以下方法：①选择限制性核酸内切酶通用缓冲液；②首先用低盐组的酶进行切割，然后加热灭活该酶，调节盐浓度，再用高盐组的酶进行切割；③一种酶切反应结束后，纯化回收DNA片段，再进行第二种酶切反应，这时不必考虑使用酶的先后顺序。总之，每种方法各有利弊，实验中需要根据具体情况选择合适的方法。

3.部分酶切

部分酶切是指选用的限制性核酸内切酶对其在DNA分子上的全部识别序列进行不完全切割，酶切只发生在部分位点。部分酶切通常是在构建基因文库或者需要酶切基因组后，为获得一定大小范围内的片段而使用的酶切方法。在实验中可以通过缩短酶切消化的反应时间或降低反应温度以约束酶的活性而达到部分酶切的目的。