2.2.3　黏性末端DNA片段的连接

DNA连接酶最突出的特点是，它能够催化外源DNA和载体分子之间发生连接作用，形成重组的DNA分子。具有互补黏性末端的DNA片段之间的连接比较容易，在DNA重组中也比较常用。

1.同一种酶产生的黏性末端的连接

在DNA分子连接中，由同一种酶产生的相同黏性末端DNA片段的连接是DNA体外连接最简单的一种方法，如图2-4所示。选用一种对载体DNA只具有唯一限制酶切位点的限制性核酸内切酶进行特异性切割，形成全长的具有黏性末端的DNA分子，然后用同一种限制性核酸内切酶对外源DNA进行切割，形成同载体相同的黏性末端。在DNA连接酶的作用下，两者通过末端碱基互补配对发生退火形成重组DNA分子。

图2-4　同一种酶产生的黏性末端的连接

（引自刘志国等，2010）

按上述方法构建的重组DNA分子也存在一些缺点：①由限制性核酸内切酶产生的具有黏性末端的载体DNA的两个末端碱基序列也是互补的，在连接反应中，很容易发生线状的载体DNA的自身环化，形成空载体，给后续的筛选造成不便。为了避免载体的重新环化，可用细菌的或小牛肠碱性磷酸酶在DNA连接之前预先处理线状的载体DNA分子，移去线状载体DNA两末端的5'磷酸基团。②由于载体和外源DNA片段用同样的限制性核酸内切酶切割，外源DNA片段可以正、反两种方向插入载体DNA中，而这对于基因克隆是非常不利的。

2.不同酶产生的黏性末端的连接

用两种限制性核酸内切酶切割载体DNA和外源DNA片段，使载体和外源目的基因的两端形成不同的黏性末端，然后在连接酶的作用下相同的黏性末端可退火连接成重组DNA分子，从而实现DNA的定向连接（directional ligation），即外源DNA只能以一个方向插入载体两个限制酶切位点之间，从而完成基因的定向克隆（图2-5）。

图2-5　不同酶产生的黏性末端的连接

（引自刘志国等，2010）

3.非互补的黏性末端的连接

当载体和外源DNA片段经过限制性核酸内切酶切割后，产生非互补的黏性末端时，将无法在DNA连接酶的作用下，利用末端碱基互补配对发生退火形成重组DNA分子。此时，通常将非互补的黏性末端修饰成平末端，再按平末端连接的方法进行连接。通常将黏性末端变为平末端的方法有：①5'突出黏性末端的补平，一般选择大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段聚合酶进行填补；②3'突出黏性末端的切平，一般使用T4DNA聚合酶或单链的S1核酸酶切平。