2.2.5 影响连接反应的因素
1.连接缓冲液
连接缓冲液大体含有以下组分：20～100 mmol/L的Tris-HCl，较多用50 mmol/L，pH值的范围为7.4～7.8，较多用7.8，目的是提供合适酸碱度的连接体系；10 mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反应；1～20 mmol/L的DTT，较多用10 mmol/L，作用是维持还原性环境，稳定酶活性；25～50 μg/mL的BSA，作用是增加蛋白质的浓度，防止因蛋白质浓度过稀而造成酶的失活。与限制性核酸内切酶缓冲液不同的是连接缓冲液还含有0.5～4 mmol/L的ATP，现多用1 mmol/L，是酶反应所必需的。
2.反应pH值
一般将缓冲液的pH值调节到7.4～7.8，较多用7.8。有实验表明，若把pH值为7.5～8.0时的酶活性定为100％，那么体系偏碱（pH值为8.3）时仅为全部酶活性的65％，当体系偏酸（pH值为6.9）时仅为全部酶活性的40％。
3.ATP浓度
T4 DNA连接酶需要ATP作为连接反应的辅助因子，其浓度对酶的影响很大。连接缓冲液中ATP的浓度在0.5～4 mmol/L，较多用1 mmol/L。研究发现，ATP的最适浓度为0.5～1 mmol/L，过浓会抑制反应。例如，5 mmol/L的ATP会完全抑制平末端连接，黏性末端的连接也有10％被抑制；当ATP的浓度为0.1 mmol/L时，去磷酸载体的自环比例最大。由于ATP极易分解，因此当连接反应失败时，除了DNA与酶的问题外，还应考虑ATP的因素。含有ATP的缓冲液应于—20℃保存，熔化取用后立即放回。连接缓冲液体积较大时最好分小管储存，防止反复冻融引起ATP分解。与限制酶缓冲液不同的是，含ATP的连接缓冲液长期放置后往往失效，所以也可自行配制不含ATP的缓冲液（可长期保存），临用时加入新配制的ATP母液。
4.反应温度与时间
温度是影响连接反应连接效率的主要因素。连接酶的最适温度为37℃，但在37℃时，黏性末端之间的氢键结合是不稳定的，它不足以抵御热破裂作用。在实际操作中综合考虑酶作用速率与末端结合速率，一般采用16℃，连接时间为4～16 h。对于一般的黏性末端，20℃30 min就足以取得相当好的连接效果，当然如果时间充裕，20℃60 min能使连接反应进行得更完全一些。对于平末端是不用考虑氢键问题的，可使用较高的温度，使酶活性得到更好的发挥。
5.连接酶浓度
T4 DNA连接酶的活性一般采用Weiss单位来衡量。Weiss单位规定，37℃20 min内可使1 nmol/L 32P在有机焦磷酸与ATP之间产生交换的酶量为1个活性单位。连接酶用量与DNA片段的性质有关，对于具黏性末端DNA片段间的连接，最适的反应酶量大约是0.1个单位；在平末端DNA分子的连接反应中，如果需要连接平末端，必须加大酶量，一般用连接黏性末端酶量的10～100倍，最适酶量为1～2个单位。连接平末端时，还可加入T4 RNA连接酶，在T4 RNA连接酶存在下，可使平末端的连接效率提高数十倍，但对黏性末端的连接并无影响。
6.DNA片段浓度
由于DNA连接反应涉及不同DNA分子（分子间连接），因此连接反应对DNA分子的末端会十分敏感。连接带有黏性末端的DNA片段时，DNA浓度一般为2～10μg/mL；连接平末端时，需加大DNA浓度至100～200μg/mL（这里浓度的计算以假定DNA片段长度为200～5000 bp为前提）。对于长度一定的DNA分子，降低浓度对分子本身环化有利。这是因为在一定浓度下，DNA分子的一个末端找到同一分子的另一个末端的概率要大于找到不同DNA分子末端的概率。如果提高DNA浓度将促进分子间的连接，因为DNA浓度增大，则在分子内连接反应发生之前，某一个DNA分子的末端碰到另一个DNA分子末端的可能性有所增大。