4.4.3　PCR产物的克隆

1.PCR产物克隆的分类

同一反应体系中如果采用的热稳定DNA聚合酶不同，则获得的PCR产物末端有所不同。如采用普通的Taq DNA聚合酶会产生3'末端有一突出的A碱基的黏性末端PCR产物，采用诸如Pfu DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶等则产生平末端PCR产物，因此依据PCR产物可将其大致分为平头连接和黏头连接两类克隆。

2.PCR产物的克隆

（1）平头连接克隆：将制备好的平头载体与平末端PCR产物或处理成平末端的PCR产物直接进行连接。载体可用EcoR V或SmaⅠ切成平头，黏性末端的PCR产物纯化后，可用DNA聚合酶Ⅰ处理成平末端。如果要求不高，PCR产物也可不加处理。

（2）黏头连接克隆：黏头连接也可以大致分为两类，一类黏头连接是用某种方法，在载体和PCR产物上产生长的可互补的黏性末端，然后连接克隆。最普遍的方法是在引物的5'端加入一段某种限制性核酸内切酶的识别序列。如果两个引物选用不同的限制性核酸内切酶识别序列，就可以做到定向连接。另一类借助于黏性末端PCR产物3'端带有一个突出的A碱基的特性，与3'端带有突出的T碱基的线状T载体直接连接克隆，这种方法一般称为T-A克隆法，其连接效率比平头连接效率高50～100倍。T-A克隆法不需使用含限制性核酸内切酶识别序列的引物，不需把PCR产物进行平端处理，不需在PCR扩增产物上加接头，即可直接高效地连接PCR产物，成为Taq DNA聚合酶PCR产物的最佳克隆方法。